灵猫方通过增强天然免疫功能抑制乙型肝炎病毒复制的研究*

朱晓骏 张 鑫 周振华 金树根 高雅婷 孙学华 杨婉凤 高月求△

1.上海中医药大学附属曙光医院肝病科 (上海, 201203) 2.上海中医药大学附属曙光医院细胞免疫实验室

据世界卫生组织报道，全球约有2.4 亿慢性HBV 感染者[1]，每年约有65 万人死于HBV 感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌( HCC)[2]，我国有慢性HBV 感染者约9300 万人，其中慢性乙型肝炎(CHB) 患者约2000 万例[3]，CHB治疗的关键是抗病毒，核苷(酸)类似物在临床上广泛应用，但血清转换率低、停药问题困扰着临床医生，中医药在我国乙型肝炎防治中发挥着重要作用。前期临床研究发现灵猫方与恩替卡韦联合治疗CHB具有协同作用[4]，因此我们进一步研究了灵猫方治疗CHB的免疫学机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞 HepG2中科院上海细胞库购买。

1.2 质粒 pHBV1.3-pCR2.1质粒，华中科技大学同济医院附属协和医院病毒研究室惠赠[5]。

1.3 药物与试剂 灵猫方(醋青皮，胡黄连各9 g，猫爪草、黄芪、仙灵脾、女贞子各15 g)，由上海中医药大学中药学院制剂工程中心加工提取水提物。方法如下：中药材加入10倍的80%乙醇回流提取两次，每次1.5 h。药液通过80目过滤，减压浓缩至2L，-20 ℃冷冻干燥，-70 ℃冷藏备用。

DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；AMV First Strand cDNA Synthesis Kit(美国)；SG Fast qPCR Master Mix(High Rox) (2X) [生工生物工程(上海)股份有限公司，中国]；HBsAg和HBeAg ELISA试剂盒(雅培，美国)；Lipofectamine®3000(ThermoFisher，美国)。

1.4 仪器 二氧化碳培养箱(HF151)，Heal Force公司；洁净工作台(SA-1480-2)，上海净化设备厂；雅培i2000化学发光免疫分析仪，美国；ABI 7500型荧光定量PCR仪，美国。

1.5 pHBV1.3-pCR2.1质粒转染HepG2 依据Lipfectamine 3000 Reagent 转染试剂说明书进行转染。

1.6 细胞培养、分组和干预 HepG2细胞接种于6孔板，每孔5×105个细胞，加入1 ml含10% 胎牛血清的DMEM培养液；在37 ℃、5%CO2和100%湿度的条件下培养24 h。共分为3个组：灵猫方低剂量组(0.25mg/ml)、灵猫方高剂量组(0.5mg/ml)和空白对照组(0.9%NaCl)。分别向空白对照组、低剂量组、高剂量组加入0.9%NaCl溶液、0.25mg/ml和0.5mg/ml灵猫方水提物干预HepG2细胞，培养24h，然后pHBV1.3-pCR2.1质粒转染48h，收集细胞和上清液。

1.7 观察指标及检测方法

1.7.1 HBsAg、HBeAg水平 采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平，方法按照试剂盒说明书进行。

1.7.2 RNA提取和 IFN-α、IFN-β、IFN-λ1、OAS1、MxA、RIG-ImRNA定量 按照Trizol说明书提取总RNA，取1 μl总RNA逆转录为cDNA，取2 μl的cDNA进行PCR反应。PCR扩增：第1步3 min，95 ℃，第2步95 ℃、7 s变性，57 ℃、10s退火，72 ℃、15 s延伸，40个循环，根据2-△△Ct法，以 β-actin作为内参照，检测IFN-α、IFN-λ1、OAS1、MxA、PRK、RIG-ImRNA的表达量。引物详见表1。

表1 RT-PCR引物(10.5 PCR 3.20PCR)

2 结果

2.1 3组转染HepG2细胞分泌HBsAg、HBeAg情况 见图1。与空白对照组比较，高、低剂量灵猫方组的HBsAg和HBeAg水平明显下降；与低剂量灵猫方组比较，高剂量灵猫方组的HBsAg、HBeAg水平更低，这提示高、低剂量的灵猫方可抑制转染HepG2细胞分泌HBsAg、HBeAg，且高剂量灵猫方作用更强。

与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与低剂量灵猫方组比较，△P<0.05

图1 3组转染HepG2细胞分泌HBsAg、HBeAg水平

2.2 2组转染HepG2细胞分泌IFN-αmRNA、IFN-βmRNA、IFN-λ1情况 见图2。

与空白对照组比较，**P<0.01；

图2 2组转染HepG2细胞分泌IFN-αmRNA、IFN-βmRNA、IFN-λ1mRNA水平

2.3 2组转染HepG2细胞分泌OAS1、MxA、PRKmRNA情况 见图3。

与空白对照组比较，**P<0.01

图3 2组转染HepG2细胞OAS1、MxA、PRKmRNA相对表达量

2.4 2组转染HepG2细胞分泌RIG-ImRNA情况 见图4。

与空白对照组比较，**P<0.01

图4 2组转染HepG2细胞RIG-ImRNA图相对表达量

3 讨论

清热解毒利湿健脾法可以起到改善肝功能、明显减轻或消除临床症状的良好效果,但无法使HBV得到抑制,在临床治疗中，在清热化湿健脾基础之上应用补肾法往往能提高疗效。王灵台教授提出“补肾法”治疗CHB[6]，灵猫方就是在此基础之上创立。中医学认为人体免疫功能低下系属机体正气不足，而人体之正气源于脾肾，充实肾精肾气，健运脾胃可能是提高机体免疫功能，清除或抑制HBV，促使病情改善和恢复的有效途径[6]。 天然免疫应答在机体抗病毒免疫中发挥着重要作用。入侵病毒的病原体相关分子模式(PAMP)会被机体的模式识别受体(PRRs)识别，从而启动天然免疫应答，如通过分泌干扰素等细胞因子抵御病毒的入侵[7]。干扰素通过信号通路引起下游基因的转录和表达，从而起到抗病毒的作用[8]。OAS1、MxA、PRK 均为干扰素的效应蛋白；慢性HBV 感染者的天然免疫应答是受到损伤的[9，10]，恢复慢性HBV 感染者的天然免疫应答是治疗CHB方法之一。我们研究发现灵猫方可以明显增加肝细胞I、III型干扰素的产生，其干扰素的效应蛋白也明显升高，因此推测灵猫方是通过增强天然免疫抑制HBV复制。

HBV 可通过自身HBeAg 和HBx 等多种蛋白成分，干扰Toll 样受体( TLRs) 和维甲酸诱导基因( RIG-I) 两种抗病毒信号转导途径，来抑制天然免疫应答的强度[11]。RIG-I介导的干扰素诱导通路主要是在细胞质内，RIG-I可识别HBVpgRNA的50-ε结构域，诱导III型干扰素的形成[12]。RIG-I-IFN-β信号通路在慢性HBV感染者中的功能受到损伤[13]。我们的研究发现灵猫方高、低剂量组细胞胞质中的RIG-I mRNA明显提高，因此推测灵猫方可能是通过提高RIG-I的表达，恢复RIG-I-IFN-β信号通路，增加干扰素合成，增强天然免疫功能，从而起到抗HBV的作用。

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