海府地区慢性HBV感染者病毒基因型与BCP/PC区变异的研究*

梁 宁 郑 青 张淑芳 张英爱 高丽娟

1海口市120急救中心 (海南 海口， 570311) 2海口市人民医院

HBV 感染自然史分为4 期：免疫耐受期、免疫清除期、免疫不全期和再活动期[1]。HBV对肝脏的损害取决于两个因素，一个是宿主免疫应答情况，另一个是HBV的基因型和异质性[2]。海南省HBsAg携带率为8.4%，有70万人的巨大传染源[3]。由于HBV基因型具有地域分布特点[4]，HBV异质性可能带来不同的临床后果，因此，笔者试图研究慢性HBV感染者自然史不同免疫状态下的HBV基因型和病毒变异状况，为慢性HBV感染者实施相应的干预措施提供实验数据与理论支持，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2017年8月期间海口市人民医院住院治疗的200例慢性HBV感染者作为研究对象。所有入选者的临床诊断均以2015年颁布的《慢性乙型肝炎防治指南》为标准[5]。依照HBV感染自然史分为4组：①A组，共50例，入选标准：HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV DNA>104copies/ml、ALT正常(1年内连续随访超过3次，ALT均在正常范围)；②B组，共50例，入选标准：HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV DNA>104copies/ml、ALT持续或间歇升高；③C组，共50例，入选标准：HBsAg(+)、HBeAg(-)、抗HBe(+)、HBV DNA低于最低检测限，1年内连续随访3次以上，ALT均在正常范围；④D组，共50例，入选标准：HBsAg(+)超过半年以上、HBeAg(-)和/抗-HBe(+)、HBV DNA≥104copies/ml，ALT超出1.5倍正常值上限。排除标准：①合并抗-HCV、抗-HDV、抗-HIV阳性者；②急性肝炎、重型肝炎、肝硬化、肝癌患者；③用免疫抑制剂治疗的患者。

1.2 实验仪器与方法

1.2.1 实验仪器 研究级别倒置相差荧光显微镜 (日本OLYMPUS IX71 )， 凝胶成像系统 (美国Bio-Rad：GelDoc XR)，梯度快速PCR仪( 美国Bio-Rad：C1000)， 电击转基因仪/MicroPluser电穿孔仪和制冰循环水浴仪( 美国Thermofisher：RTE 7)，扩增仪 (美国Bio-Rad：MJ MINI )，电子天平(美国奥豪斯：SPS202F)，涡旋混合器(美国Scientific Industries：Vortex-Genie 2 )，杂交/交联箱(美国Boekel：Bambino(230301-2))，真空离心浓缩仪(德国Eppendorf：5301 plus)，超声波细胞破碎仪(美国MISONIX：XL2000)，高温灭菌器(日本Hirayama：HVE-50)，多功能酶标仪(美国Bio-rad：Xmark )，超低温冰箱(-85℃)、低温冰箱(-20℃)、低温高速离心机、台式高速离心机、电泳仪、无菌超净工作台、测序仪器、切割式匀浆机、FR-紫外强见光分析系统、手提式长波长紫外灯、贝克曼DXC800全自动生化分析仪，雅培16000生化免疫一体机，日立7600全自动生化分析仪，全自动酶标检测仪等。

1.2.2 HBV基因型分析 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RELP)，首先通过扩增S基因区，再根据特殊的基因型特异性位点设计内切酶，具体步骤如下：提取HBV DNA 2μl，总体积20μl，第一轮扩增用BS1和POL2作为外引物，经过变性、退火、延伸后，取出5μl产物，反应总体积50μl。第二轮扩增用YS1和YS2作为内引物，再次经过变性、退火、共循环、再延伸5min，取出4μl产物电泳并观察；取阳性产物5μl， Bsrs I和StyI各4u酶切，取产物电泳并观察。

1.2.3 PC/BCP变异检测 ①CX片段(nt1643-1974)扩增： 提取HBV DNA2μl，以外引物P9和P35扩增，总体积20μl，经过变性、退火25s、延伸、共循环、再延伸后，取产物5μl，以P9和CSP为内引物再扩增，总体积50μl，再经过变性、退火、共循环、再延伸后，取产物4μl，电泳并观察。②测序：取扩增成功且产物带明显的样本测序，引物为CSP，HBV基因组第1762A/1764T以及1896G核苷酸变异的判断采用Cluster X 进行序列排列和人工确认。

1.3 检测指标 ① 检测4组患者的基因型。② 4组患者HBV的PC/BCP变异情况并计算比率。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0软件对数据进行处理。计数资料采用(n)或百分比(%)表示，两组间比较采用χ2检验，取P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 4组患者HBV基因型的检测情况 见表1。

表1 4组患者HBV基因型分布情况比较 [n(%)]

组间比较，P均>0.05

2.2 4组患者HBV变异类型及比率 结果显示，PC区A1896终止密码变异均发生于基因型B，BCP 区A1762T/G1764A双变异均发生于基因型C。随着HBV感染自然史的进展，PC变异的比率并未出现太大变化，组间比较P均>0.05，差异无统计学意义；但BCP变异的比率却逐渐增高，组间比较P均<0.05，差异具有统计学意义。

表2 4组患者HBV变异类型及比率比较 [n(%)]

3 讨论

HBV 基因型的分布具有地域特点，目前已证实，在我国大陆地区主要以B、C两型为主，南方B型多见，北方C型多见[6]。研究表明HBV基因型可能影响着慢性肝病的临床表现和病程转归[7]。有学者发现从慢性HBV感染到肝硬化、再到原发性肝癌，基因C型患者所占的比例显著上升；相对于B型，C型患者更容易出现较严重的肝脏病变[8]。本研究排除了肝硬化和原发性肝癌患者，仅针对慢性HBV感染的4个不同阶段，结果显示，4个免疫阶段患者HBV基因型的分布情况均以B型为主，且其构成比例差异不大(P>0.05)，与既有的文献结论相符。

HBV病毒较其他DNA病毒存在较高的变异率，原因是HBV复制过程中的逆转录酶并不具有校正修复功能，其中最主要的是PC变异和BCP变异[9]。研究表明基因型B、D、E及部分C、F基因型较易出现PC变异，基因型C则更易出现BCP双变异[10]。有文献指出BCP变异与慢性HBV感染的进展有关，与原发性肝癌具有更为密切的关系，而PC变异则与肝病进展不甚密切[11]。病毒学研究发现BCP可以通过对PC-mRNA和C-mRNA的控制来调节HBV的转录，当发生BCP变异后，一方面PC-mRNA被抑制，改变了PC-mRNA和C-mRNA的比率，病毒的复制效率发生了改变；另一方面，生成了肝细胞核因子HNF1的结合位点，使得pgRNA的转录和HBcAg合成增强，核心颗粒增加，从而显著地增强HBV复制，引发了更为严重的肝细胞炎症、坏死和纤维化修复；同时，BCP变异还能诱导HBV X蛋白的氨基酸改变，而发生改变后的X蛋白在HBV感染发展为HCC过程中起着重要作用[12]。笔者发现PC变异均发生于基因型B，BCP变异均发生于基因型C，随着慢性HBV 感染自然史的进展，PC变异的比率并未出现太大变化，但BCP变异的比率却逐渐增高，这再次证实BCP变异在肝病进展中可能具有的作用。

综上所述，海府地区慢性HBV感染进程的4个阶段(免疫耐受期、免疫清除期、免疫不全期和再活动期)均以B型基因为主，但是随着慢性HBV 感染自然史的进展，BCP变异比率逐渐增高，表明BCP变异可能是原发性肝癌进程中的重要事件。

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