血竭素高氯酸盐对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及海马TGF-β1通路相关蛋白的影响

张路赢，马丹霞，杨艾堂，彭会明

0 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种常见的中枢性神经系统退行性疾病，是一种由多基因和多因素影响的神经性疾病，但具体的发病机制尚未完全明确[1]。AD患者主要表现为认知功能障碍、语言障碍、记忆障碍和人格改变等，严重影响患者的社交和生活质量[2]，因此，探究有效治疗AD的药物是神经内科医生研究的重点。血竭素是从血竭中提取的，其主要有效成分是黄酮类物质[3]，具有抗菌消炎、活血生肌、收敛止血的功效[4]，近年来研究表明，炎症反应在AD的发生、发展中起重要作用[5]，而且血竭素高氯酸盐对AD的疗效尚未见报道。本研究以阿尔茨海默病模型大鼠为研究对象，探究血竭素高氯酸盐对模型大鼠学习记忆及海马转化生长因子β1(TGF-β1)通路相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及饲料 健康雄性SD大鼠70只，SPF级，6～8周龄，体重(150±20)g，购自北京生命科学研究所，许可证号：SYXK(京)2015-0002。

1.1.2 主要材料与仪器 血竭素高氯酸盐(纯度为99.2%)购自中国药品生物制品检定所；多奈哌齐(国药准字H20050978)购自卫材(中国)药业有限公司；TRIzol reagent购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒购自宝生物(大连)有限公司；TaqDNA聚合酶购自英国NEB公司；兔抗鼠Aβ、TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；3K15超低温离心机购自德国Sigma公司；超净台购自上海苏净实业有限公司；引物序列由深圳华大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 阿尔茨海默病动物模型建立 随机选取10只大鼠作为假手术组，其余大鼠按照文献资料构建AD模型[6]，具体操作如下，将大鼠称重，腹腔注射4%水合氯醛进行麻醉，头部剪毛消毒，将大鼠固定于脑立体定位仪上，于头皮正中切开，剥离右侧颅顶骨膜，用颅骨钻刺一2 mm的骨窗，剥开硬脑膜，用微量注射器向大鼠大脑海马区注入5 μl Aβ1-42磷酸盐溶液(注射速度1 μl/min)；假手术组以相同方法注射等量磷酸缓冲液，手术后均用牙科水泥固定骨孔处，干燥后缝合头皮，给大鼠腹腔注射120 000 U/kg，将大鼠回笼饲养48 h(排除手术和麻醉干扰)。

1.2.2 动物分组 将造模成功的大鼠随机分成5组，每组10只，分别命名为模型组、多奈哌齐组、DP低剂量组、DP中剂量组、DP高剂量组，多奈哌齐组给予0.33 mg/kg多奈哌齐，DP组按低、中、高剂量分别给予10、20、30 mg/kg DP，所有大鼠均行灌胃治疗，假手术组及模型组给予等量容积生理盐水，持续治疗4周。

1.2.3 六组大鼠水迷宫(Morris water maze，MWM)实验 持续治疗4周后，采用MWM实验检测六组大鼠学习记忆能力：①学习训练：将大鼠分别从4个象限放入水中，记录其在2 min内找到平台的时间(s)，连续训练5 d，保证每只大鼠每天训练次数相同；②定位航行实验：在MWM实验的第5天，将大鼠从某一固定的象限放入水中，记录其找到平台的时间(s)，即为逃避潜伏时间，超过2 min的即为2 min，连续测试4 d，保证每天大鼠的入水顺序不同；③空间探索实验：定位航行实验结束后，撤走安全平台，将大鼠从放置平台象限的对侧放入水中，记录大鼠2 min内穿越平台的次数(即为探索次数)。

1.2.4 六组大鼠脑组织分离 按照“1.2.1”项中的方法将大鼠麻醉，酒精消毒后，在无菌的超净台剪开大鼠胸腔，暴露心脏，用4%多聚甲醛灌注固定，直至肝脏变白、四肢僵硬，断头后剪开头皮及颅骨，取出全脑，在体视显微镜下去除脑膜及血管后，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.5 qRT-PCR检测六组大鼠海马组织中Aβ mRNA表达水平 取六组大鼠海马区域组织，用TRIzol reagent提取其总RNA，用反转录试剂盒将其反转成cDNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。根据Aβ的cDNA序列设计引物，以GAPDH为内参进行qRT-PCR。PCR的反应体系：5×缓冲液10 μl，TaqDNA聚合酶1 μl，上游引物F2 μl，下游引物R 2 μl，10 mmol dNTP mix 1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 33 μl；PCR的反应条件：预变性：95 ℃ 5 min，变性：95 ℃ 30 s，延伸：62 ℃ 15 s，40个循环。采用最大二阶导数法(2-△△Ct)对数据进行统计，计算Aβ的相对表达量。

1.2.6 免疫组化染色检测六组大鼠海马组织中Aβ的表达水平 取六组大鼠海马区域组织，用冰冻切片机制作组织切片(不超过5 μm)，将组织切片在92～98 ℃条件下存放20 min进行抗原修复，滴加正常山羊血清中和非特异性反应后，在组织玻片上滴加稀释的兔抗鼠Aβ多克隆抗体，于4 ℃过夜放置，复温后滴加二抗，于避光条件下室温孵育1 h，用甘油封片后，于显微镜下观察六组大鼠海马组织中Aβ的表达情况，并采集照片(400×)。

1.2.7 Western blot检测海马组织中TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2表达水平 取六组大鼠海马区域组织，加入2 ml细胞裂解液，提取总蛋白，以GAPDH为内参，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，每孔上样体积20 μl，电泳结束后，半干转膜仪转膜50 min，分别滴加兔抗鼠TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2多克隆抗体，置于4 ℃下过夜，滴加二抗后37 ℃放置1 h。加入发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像，Gel-Pro analyzer4软件对SDS-PAGE电泳图目的条带进行扫描，分析TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2表达水平。

2 结果

2.1 定位航行实验检测六组大鼠逃避潜伏时间 与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏时间明显延长(P<0.05)，提示AD模型制备成功。与模型组相比，多奈哌齐组和DP组大鼠逃避潜伏时间明显缩短(P<0.05)，且随DP剂量增加，大鼠逃避潜伏时间逐渐缩短，呈剂量依赖性。见表1。

2.2 定位探索实验检测六组大鼠穿越平台的次数 与假手术组相比，模型组大鼠穿越平台的次数明显减少(P<0.05)。与模型组相比，多奈哌齐组和DP组大鼠穿越平台的次数明显增加(P<0.05)，且呈剂量依赖性，结果如图1所示。

2.3 qRT-PCR检测海马组织中Aβ mRNA表达水平 与假手术组相比，模型组大鼠海马组织中Aβ mRNA的表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比，多奈哌齐组和DP组大鼠海马组织中Aβ mRNA的表达水平显著降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见图2。

图1 六组大鼠定位探索实验穿越平台的次数

注：A.假手术组，B.模型组，C.多奈哌齐组，D.DP低剂量组,E.DP中剂量组,F.DP高剂量组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与多奈哌齐组比较，@P<0.05；与DP低剂量比较，△P<0.05；与DP中剂量组比较，▲P<0.05

图2 qRT-PCR检测海马组织中Aβ mRNA表达水平

注：A.假手术组，B.模型组，C.多奈哌齐组，D.DP低剂量组,E.DP中剂量组,F.DP高剂量组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与多奈哌齐组比较，@P<0.05；与DP低剂量比较，△P<0.05；与DP中剂量组比较，▲P<0.05

2.4 免疫组化染色检测六组大鼠海马组织中Aβ的表达水平 与假手术组相比，模型组大鼠海马组织中Aβ的表达水平升高。与模型组相比，多奈哌齐组和DP组大鼠海马组织中Aβ的表达水平降低，且随着DP剂量增加，大鼠海马组织中Aβ的表达水平逐渐降低见图3。

2.5 Western blot检测海马组织中TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2表达水平 与假手术组相比，模型组大鼠海马组织中TGF-β1的表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比，多奈哌齐组和DP组大鼠海马组织中TGF-β1的表达水平显著升高(P<0.05)，且随DP剂量增加，大鼠海马组织中TGF-β1的表达水平逐渐升高，呈现剂量依赖性，见图4、图5。

表1 六组大鼠定位航行实验逃避潜伏时间比较(s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与多奈哌齐组比较，@P<0.05；与DP低剂量组比较，△P<0.05；与DP中剂量组比较，▲P<0.05

图3 免疫组化染色检测六组大鼠海马组织中Aβ的表达水平(400×)

图4 Western blot检测海马组织中TGF-β1、SMAD2和p-

注：1.假手术组，2.模型组，3.多奈哌齐组，4.DP低剂量组，5.DP中剂量组，6.DP高剂量组

图5 海马组织中TGF-β1的相对表达量

注：A.假手术组，B.模型组，C.多奈哌齐组，D.DP低剂量组,E.DP中剂量组,F.DP高剂量组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与多奈哌齐组比较，@P<0.05；与DP低剂量比较，△P<0.05；与DP中剂量组比较，▲P<0.05

Western blot检测结果显示，各组间SMAD2的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组相比，模型组大鼠海马组织中p-SMAD2的表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比，多奈哌齐组和DP组大鼠海马组织中p-SMAD2的表达水平显著降低(P<0.05)，且随DP剂量增加，大鼠海马组织中p-SMAD2的表达水平逐渐降低，呈现剂量依赖性。见图4、图6。

图6 海马组织中SMAD2和p-SMAD2的相对表达水平

注：A.假手术组，B.模型组，C.多奈哌齐组，D.DP低剂量组,E.DP中剂量组,F.DP高剂量组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与多奈哌齐组比较，@P<0.05；与DP低剂量比较，△P<0.05；与DP中剂量组比较，▲P<0.05

3 讨论

中医学认为，AD属于老年痴呆的范畴，以细胞外老年斑(SP)、神经细胞内神经纤维缠结(NFT)和神经元丢失为主要的病理改变[7]。大脑皮层和海马组织中出现大量β-淀粉样蛋白(Amyloid beta，Aβ)为其直接的致病原因[8]，因此，本研究采用向大鼠大脑海马区注射Aβ1-42磷酸盐溶液的方法制备AD模型。结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏时间明显延长、穿越平台的次数明显降低，提示AD模型制备成功。

目前，治疗AD的药物主要有扁豆碱、他克林、维吖啶、多奈哌齐和西坦类药物，这些药物治疗AD有一定疗效，但也存在诸多缺点，如药物安全范围小、半衰期短，还会引起哮喘、心脏功能障碍、肝功能异常及消化不良等[9]。近年来研究表明，AD的发生、发展与大脑内的慢性炎症反应密切相关[10]。Pfützner等[11]研究表明，慢性炎症能够促进胶质细胞释放炎性细胞因子IL-6。IL-6能够刺激神经细胞产生淀粉样前体蛋白，进而促进AD的发生、发展。DP的主要有效成分是血竭素，血竭素来源于血竭，具有抗菌消炎、活血生肌的功效。袁庆等[12]研究表明，龙血竭能够抑制小胶质细胞活化，进而抑制小胶质细胞释放炎性因子，抑制AD的发生、发展。本研究表明，采用DP对AD大鼠模型治疗后，与模型组相比，DP组大鼠逃避潜伏时间明显缩短、穿越平台的次数明显增加、大鼠海马组织中Aβ的表达水平显著降低，且呈剂量依赖性，结果提示，DP能够清除海马组织中Aβ，进而抑制AD的发生、发展。

AD是一种多因素相关的神经性疾病，但具体的发病机制尚未完全明确，有研究表明，TGF-β1通路在神经系统内发挥着重要作用[13-14]。Chen等[15]在AD模型大鼠脑侧注射TGF-β1，结果表明，TGF-β1能够抑制胶质细胞介导的炎症反应，从而减轻AD模型大鼠神经退行性病。SMAD2是TGF-β1下游的信号分子之一，TGF-β1/SMAD2信号通路能够将细胞表面的信号传导到细胞核，进而调节细胞核内个基因的表达。Ueberham等[16]研究表明，SMAD2在大脑和神经的发育过程中发挥着重要作用，而且参与AD的发生、发展过程。Song等[17]研究表明，Dab2能够靶向作用于小鼠的TGF-β1/SMAD2信号通路，抑制APP/PS1小鼠脑内神经损伤，进而抑制AD的发生、发展过程。SMAD2磷酸化后，无法进入细胞核，导致p-SMAD2在细胞内异常聚集，进而导致神经元缠结。因此，降低SMAD2的磷酸化水平，有助于抑制AD的发生发展。然而DP对TGF-β1和p-SMAD2蛋白的调控尚未见报道。本研究表明，DP能够上调TGF-β1的表达水平，下调SMAD2的磷酸化水平，进而抑制AD的发生发展，且存在剂量依赖关系。

综上所述，DP能够改善AD模型大鼠的学习记忆，推测这一作用是通过调控海马组织中TGF-β1和p-SMAD2的表达水平实现的，为AD的临床治疗提供一定理论基础。

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