甲强龙对脑出血后灶周MMP-9 表达及其 神经损伤的保护作用*

毛珂 雷町 游潮 肖安琪 郑松平 陈锐奇 任艳明

(四川大学华西医院神经外科,四川 成都 610041)

自发性脑出血(Intracranial Hemorrhage， ICH)是临床上常见的出血性卒中[1]，在我国发病率约为60～80/10万人口/年。其起病突发而凶险，有很高的致残率和死亡率[2]。有文献报道，死亡率可高达20%～75%，而且多数幸存者发病后遗留显著神经功能障碍[3]。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一组降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的蛋白酶，后者是构成血管基底膜的主要成分，其完整性在一定程度上决定着血管的完整性[4]。大量的动物研究表明，MMP-9能在脑外伤、脑缺血性卒中以及出血性卒中高表达。它不仅能通过溶解血脑屏障基膜，引起血源性水肿，亦能介导炎性反应加重炎性浸润，甚至参与触发周围神经细胞的凋亡[2-5]。

甲强龙是被临床广泛使用的糖皮质激素[5]，其在神经领域中主要用于减轻严重的脑水肿与垂体激素的替代治疗。有研究表明，糖皮质激素能通过有效抑制 MMP-9的表达情况，改善脑缺血，降低炎性反应，减少脑水肿和神经功能损伤[6]。探讨本实验通过对比观察甲强龙干预后的脑出血大鼠及对照空白组脑出血后的脑水肿程度、神经功能评分、活化小胶质细胞数量、以及MMP-9蛋白表达情况，以论证甲强龙对脑出血后的神经保护作用，同时进一步探讨脑出血继发神经功能损伤的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠 30只(230～260g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物随机分为四组，即假手术对照组、脑出血组、甲强龙干预组、空白对照组，每组各7只。于四川大学高新区动物实验室以标准饲料分笼喂养。实验室温度：19～21°C；光照：12小时。术前4周每周以鼠尾无创血压仪监测并记录收缩压(SBP, systolic blood pressure)及平均动脉压(MAP, mean arterial blood pressure)。实验大鼠术前6小时禁食、禁饮。

1.1.2 实验器材 智能无创鼠尾血压仪购于澳大利亚PowerLab公司，立体定向仪购于成都光电仪厂，石蜡切片机购于德国Leica公司，主要试剂有10%水合氯醛、75%乙醇、5%聚维酮碘、伊红酒精溶液、苏木紫染色液、中性树胶等。

1.2 实验方法

1.2.1 建立脑出血大鼠模型 术前将大鼠称重后，用10%水合氯醛以0.4g/kg进行腹腔注射麻醉，放置约10分钟使麻醉生效，水平固定大鼠头部于立体定向仪，对术区进行备皮，以75%酒精棉签擦洗术区并以2%碘伏消毒术区3遍。以10号圆刀沿正中矢状线切开头皮长约1.5cm，盐水棉球分开皮肤及皮下组织暴露前囟。钻孔点设定为前囟前方0.2mm、中线右侧3mm。以微型手钻钻孔，孔径约1mm。固定微量注射器(100ul型)于立体定向仪并调整仪器臂使针头尖部恰好位于骨孔中。以无菌注射器穿刺鼠尾动脉抽取动脉血0.1ml，并迅速转移至微量注射器中；垂直向下推进约5mm，缓慢注射大鼠自体血50ul，保持注射时间大于60秒。注射后留置注射器针头10分钟，再缓慢退出微量注射器。以骨蜡封闭骨孔，1号丝线仔细缝合头皮并再次消毒。术毕，置大鼠于37°C温箱苏醒；假手术组依照相同操作方式向基底节区注射50ul生理盐水。

1.2.2 甲强龙干预方法 分别在建模术后1小时及24小时后以35mg/kg的甲强龙(生理盐水配液5ml/kg)腹腔注射；空白对照组在术后1小时及24小时后注射同等剂量生理盐水，余同实验组。

1.2.3 脑水肿测量 方法同前两部分，利用干湿重法在基底节出血模型建立术第1、3、7天检测脑组织含水量。公式：脑组织含水量=(湿重-干重)/ 湿重×100%。

1.2.4 神经功能评分 依据神经功能缺损评分表(Neurological Severity Score, NSS)，由两名神经外科医师在基底节出血模型建立术后第1、3、7天对实验大鼠进行评分。

1.2.5 免疫组化染色 术后第3天，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，开胸灌注心脏，固定并提取新鲜脑组织。置于4%多聚甲醛中固定24小时后依次给予75%、85%、95%、95%和100%各级乙醇进行脱水。之后放置在氯仿中透明并进行浸蜡包埋。用切片机对包埋好的脑组织蜡块进行冠状切片(层厚约5μm)。将切片贴于载玻片，放置60°C恒温箱中烘烤。二甲苯溶解切片中的石蜡，经各级乙醇至蒸馏水洗；3% H2O2进行温室培育15分钟，山羊血清工作液封闭后，一抗二抗依次孵育，入SABC于室温下孵育20分钟，PBS持续冲洗后，通过DAB显色，蒸馏水冲洗后常规封片。

1.2.6 统计学分析 通过SPSS 20.0软件进行本实验数据的统计学分析。均数间的比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲强龙对脑出血后脑组织含水量的影响 测量四组大鼠术后第1、3、7天脑组织含水量。结果显示，脑出血组脑组织含水量明显高于假手术对照组(P<0.05)，甲强龙干预组的脑组织含水量均在各时间点均低于空白对照组(P<0.05)，见图1。

图1假手术对照组、脑出血组、甲强龙干预组、空白对照组术后第1、3、7天的脑组织含水量

Figure1Watercontentofbraintissueonthe1st,3rd,7thdayafteroperationinshamoperationgroup,ICHgroup,methylprednisolonegroupandcontrolgroup

2.2 各组神经功能评分 利用NSS表对四组实验大鼠在术后第1、3、7天行神经功能评分，结果显示脑出血组神经功能评分明显低于假手术对照组(P<0.05)，甲强龙干预组大鼠神经功能评分均高于空白对照组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。2.3 各组免疫组化染色 术后第3天的OX-42免疫组化染色显示脑出血组血肿周围有大量内小胶质细胞被激活，甲强龙干预组大鼠阳性细胞数少于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、图4。

2.4 各组MMP-9 蛋白表达 Western Blot结果显示，脑出血组大鼠的MMP-9蛋白表达明显高于假性手术组(P<0.05)。甲强龙干预组的MMP-9蛋白表达较空白对照组明显下降(P<0.05)，见图5。

图2假手术对照组、脑出血组、甲强龙干预组、空白对照组术后第1、3、7天的神经功能评分

Figure2Neurologicalscoresonshamoperationgroup,cerebralhemorrhagegroup,methylprednisolonegroupandcontrolgrouponthe1st,3rd,7thdayafteroperation

图3术后第3天的OX-42涂片显示假手术对照组、脑出血组、甲强龙干预组、空白对照组术后的活化小胶质细胞数量

Figure3OX-42smearsonpostoperativeday3showedthenumberofactivatedmicroglialcellsinshamoperationgroup,intracerebralhemorrhagegroup,methylprednisolonegroupandcontrolgroup

图4 术后第3天的OX-42免疫组化染色显示 Figure 4 OX-42 immunohistochemical staining on day 3 after surgery

3 讨论

诸多破坏血脑屏障的途径中，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达被证实在其中起着关键的致病作用[6]。MMPs 是一类锌依赖性胞外蛋白酶家族，其中MMP-2主要参与新生血管形成，而MMP-9则主要参与水肿形成[7]。大量研究证实，MMP-9能降解血管壁的重要结构，包括细胞外基质蛋白，细胞表面分子及其他细胞外物，增加血管渗透性并导致血源性脑水

图5假手术对照组、脑出血组、甲强龙干预组、空白对照组术后MMP-9蛋白表达情况

Figure5MMP-9proteinexpressioninsham-operationcontrolgroup,ICHgroup,methylprednisolonegroupandblankcontrolgroup

肿[8]。我们实验研究显示，高血压脑出血大鼠的MMP-9异常的高表达伴随更加严重的脑水肿和神经废损，其结果和国外的研究报道基本一致。此外，MMP-9的过度表达能产生其他恶性的效应，包括介导细胞死亡与炎性反应。有研究观察到缺失MMP-9基因的大鼠脑出血后神经功能的废损更轻[9]。目前 MMP-9是否参与自发性脑出血的发病机制尚不得而知。有研究报道，MMP-9参与了阿尔茨海默病患者的脑淀粉样血管病出血[10]。

甲强龙是一种临床上常见的合成类糖皮质激素。大量研究表明糖皮质激素能抑制氧自由基诱导的脂质过氧化，反向细胞内钙的积累，防止神经退化，并且抑制血管性水肿、炎症反应和脑损伤[11]。目前甲强龙主要集中在垂体激素的替代治疗以及颅脑外伤和肿瘤引起的脑水肿控制方面，而已有的糖皮质类激素对自发性脑出血脑保护的研究报道非常有限。以往的地塞米松的脑出血动物研究表明，高剂量或早期给药可能是有益的[12]，然而也有学者的研究表明，它不能改善神经功能，甚至可能导致恶性结果[17]。

为探明甲强龙是否对脑出血后有神经保护作用以及其保护机制，我们在这部分实验中对比甲强龙干预组和对照组大鼠的脑水分含量，神经功能评分，小胶质细胞活化以及 MMP-9的表达情况。通过对比两组大鼠，甲强龙干预组的脑水肿程度与神经功能评分较对照组大鼠在各时间点都有显著好转，同时活化的小胶质细胞数量也明显下降。在 MMP-9蛋白表达方面，甲强龙干预组的MMP-9相对对照组显著被抑制。我们推测甲强龙是通过抑制MMP-9表达改善了继发性神经功能损伤从而达到神经保护的作用。Harkness发现糖皮质激素能部分抑制脑微血管内皮细胞的活化导致的MMP-9表达增加[13]，这一结果也是支持了我们的推论。 MMP-9的表达下调使继发的血脑屏障破坏减少，从而直接减少血肿局部的血管源性脑水肿，还能通过调节水通道蛋白-4的表达降低围ICH含水量[14]。在抗炎作用方面，甲强龙能通过抑制毛细血管扩张减轻白细胞浸润和吞噬作用。虽其机制尚不清楚，然有研究提示MMP-9表达能促进小胶质细胞活化[18]，说明甲强龙抑制MMP-9表达后其介导的小胶质细胞活化伴随减少。

甲强龙作为一种糖皮质类激素，是否适用于治疗脑出血后脑水肿以改善ICH的预后存在争议。其主要原因为：①自发性脑出血患者往往除合并高血压以外还合并其他全身基础疾病，如糖尿病，动脉粥样硬化等，使用甾体类激素可能加重其他基础疾病情况，影响患者预后。有学者甚至认为它在非肿瘤学的脑水肿方面的使用是有禁忌甚至是无效的，利尿剂和高渗疗法是降低ICH患者水肿和颅内压的唯一行之有效的方法[15]。②目前针对出血性卒中使用甾体类药物的基础和临床研究尚十分不足，特别是在安全的药物计量和治疗干预的时间窗方面研究尤为缺乏。③甾体类的副作用可能影响患者预后，如免疫下降，感染和胃肠道出血风险增加。然而也有学者通过临床试验发现，糖皮质激素在治疗原发性幕上ICH未必不安全，甚至能改进ICH患者的生存质量。若在较早的时间窗中，短时间使用高剂量的糖皮质激素可能避免不利的影响，如高血糖症，感染和消化道出血，且类固醇在卒中治疗中减少脑水肿具有明显的作用[16]。然而，欲进一步明确甲强龙对于治疗自发性脑出血的临床价值，仍需大量临床以及动物模型研究。

4 结论

实验结果显示，甲强龙通过抑制高血压脑出血大鼠的MMP-9表达，能减少高血压脑出血大鼠血肿局部的血管源性脑水肿，并通过抑制高血压脑出血大鼠毛细血管扩张以及减轻白细胞浸润和吞噬作用从而减少大鼠局部血肿的炎性程度。对脑出血大鼠具有神经保护作用及保护机制，通过改善继发性神经功能损伤从而达到神经保护的作用。

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