血清microRNA126和microRNA1检测对心衰诊断价值的研究*

浩日瓦，娜日罕，周 红，董 莉(内蒙古医科大学附属医院检验科，呼和浩特 010050)

心力衰竭(hear failure，HF)是由各种心脏结构或功能性疾病所导致的心室功能受损，以器官、组织血液灌注不足为临床表现的一组临床症状。急性心肌梗死(acute myocardial infartcion AMI)是我国心力衰竭的主要病因[1]；扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一类以左心室或双心室扩大伴收缩功能障碍为特征的心肌病，其终末期结果也为心力衰竭。因此对心衰的早期诊断尤为重要，而目前实验室常用的N端脑钠肽(NT-proBNP)、肌钙蛋白(cTnT)，因其受到诸多因素影响，诊断意义有限。有报道认为，microRNA能够调节多种心脏疾病的病理过程，并呈异常表达[2]，而microRNA126(血管内皮细胞及血管功能密切相关)和microRNA1(心肌肥大相关)是否可以作为新的诊断标志物，现报告如下：

1材料与方法

1.1 研究对象 选取2015年9月～2017年1月在我院心内科住院确诊的AMI后心衰患者45例,(诊断依据2015年心梗后心衰诊断指南)，男性23例，女性22例，年龄45～82岁。扩心病后心衰患者30例(诊断依据2015年扩心病心衰诊断指南)，其中男性17例，女性13例，年龄47～77岁。选取同期在我院进行健康体检的健康者20例为对照组，其中男性10例，女性10例，年龄40～83岁。

1.2 仪器与试剂 采用赛默飞世尔科技公司Series 4’ A2型实时荧光定量PCR扩增仪，美国伯乐公司的 CFX96 REAL-TIME system；miRcute miRNA提取分离、合成、荧光定量检测试剂盒(天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：两组患者入院即刻使用抗凝分离胶管采集全血5 ml，于湘仪TDZ5-W5离心机3 000 r/min离心5 min分离血清，使用无RNA酶的离心管于-80℃冰箱，健康对照组标本采集及处理与上两组标本相同。

1.3.2 miR-1，miR-126表达量检测：采用qRT-PCR技术。

1.3.3 引物设计：miR-1，miR-126引物及内参引物U6，外参均由天根生化科技(北京)有限公司提供。miR126引物序列：UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG，U6内参引物序列：ATGGACTATCATATGCTTACCGTA；miR1引物序列：CTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG，检测外参引物序列：TAATACGACTCACTATAGGG。miR-1，miR-126，内参基因为U6 RNA，miR-1及miR-126表达相对量为 2-[( CtmiR-1-CtU6)病例组-(CtmiR-1-CtU6) 对照组]，2-[( CtmiR-1-CtU6 )病例组-(CtmiR-1-CtU6) 对照组]。

1.4 NTproBNP，cTnT，LEVF检测及诊疗记录 血清NTproBNP，cTnT检测使用罗氏全自动电化学发光仪，按说明书进行，所有检测均在室内质控在控下进行。

2结果

2.1 血清miR-126，miR-1检测结果 见表1。两组患者血清miR-126，miR-1较对照组显著下降(t=72.14,38.05,均P<0.001)。AMI组与DCM组比较，差异有统计学意义(P>0.05)。

表1 DCM组及AMI组心衰患者mir-126及mir-1相对表达量

2．2 miR-126，miR-1与NTproBNP，cTnT，心胸比，射血分数相关性分析 见表2。

表2 心衰患者miR-126，miR-1与cTnT，NTproBNP，LVEF相关性

心衰患者血清miR-126，miR-1相对含量与NTproBNP，cTnT，心胸比呈负相关，与LVEF呈正相关，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 血清miR-126，miR-1对心衰的诊断效能 见表3。

表3 心衰患者miR-126，miR-1的诊断效率比较(%)

miR-126，miR-1灵敏度仅为55%，65.3%，低于cTNTt pro-BNP，差异无统计学意义(P<0.05)；但特异度为85%，78.2%，与cTnT，NTpro-BNP比较差异无统计学意义(P>0.05)；阳性预测值为77.23%，78.44%低于cTnT和NTpro-BNP，差异有统计学意义(P<0.05)。阴性预测值和准确度，差异无统计学意义(P>0.05)。结果显示血清miR-126和miR-1对心衰有诊断意义。

2.4 心衰患者12个月预后COX回归分析 对两组病人12个月预后进行生存分析，发现校正心肌标志物后miR-126 的12个月相对危险度为0.53，(95% CI 0.451～1.452，P=0.052)，0.73(95% CI 0.516～1.529，P=0.062)，差异无统计学意义。miR-1的12个月生存分析其相对危险度分别为1.35(95% CI 0.542～1.893，P=0.073)，2.35(95% CI 0.432～1.939，P=0.053)，差异无统计学意义。

3讨论MicroRNAs(miRNAs)是内源性非编码小RNA，长约18～23个核苷酸序列，可通过结合mRNA的3’非翻译区抑制转录和翻译过程[3]，调节基因的表达。miRNAs多数存在于组织细胞中，并与心肌发育、细胞肥大、纤维化等有关[4]；其中部分miRNAs存在于外周循环，可用于外周血的检测，为我们实验的可行性提供了依据。

miR-1 是心脏和肌肉特异性的miRNA，也是心脏中含量最丰富的miRNA，miR-1通过Ca/CaM(Ca与CaM的比值为心肌肥大信号通路的重要介质)途径引起心肌肥大继而导致心衰[5]，心衰时miR-1下调，可引起心肌细胞肥大，其原因在于：miR-1下调后使靶基因钙调蛋白(calmodulin，CaM)和肌细胞增强因子-2(myocyte enhancer factor，Mef2)表达增加，Ca与CaM比值下调活化钙神经素，进一步引起转录因子激活T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)的活化，CN-NFAT通路激活导致心肌细胞肥大[6]。

miR-126能够通过调控Spred-1，VCAM-1，HoxA9，v-Crk，EGFL-7和VEGF等基因的表达，参与调节血管发育、新生血管形成以及血管炎症反应等血管的生理和病理生理过程[7，8]。其机理是：miR126以VCAM-1为靶基因调节血管炎症反应[9](此作用只能在翻译水平进行，因VCAM-1的3’UTR区没有能与miR126精确配对区域，无法在转录水平调节VACM-1的含量[4])；VCAM-1是由活化内皮细胞分泌的一种细胞因子，可以使活化的血管内皮与炎症细胞黏附，当miR126含量下降时，其对VCAM-1的抑制作用减弱，使白细胞和血管内皮细胞的黏附加强。因此，检测循环miR-126可以推测血管炎症程度，评估心衰及预后[6，10]，对临床有重要意义。此为内源性microRNA126的降低促进白细胞与血管内皮细胞的黏附的原因[5]。

我们的研究发现：两组心衰患者中miR-1，miR-126与对照相比显著下调；而两组患者间差异均无统计学意义。这种差异表达使其有潜力用于心衰的诊断，但不能作为区分心梗后心衰与扩心病心衰的依据。

我们的研究结果与Gidldf等[5，11]的研究结果相同，即：miR-126显著下调。但Gidldf等[5]的研究发现其上调和下调与时间相关，同时其不同时间点的表达曲线与cTNT表达曲线一致，但无相关性；而我们的结果是miR-126相对含量与cTnT浓度呈负相关。存在出入可能原因是：miR-126 是血管特异性的miRNA，在AMI梗死处血管内浓度最高，如直接取材与梗死处浓度必然高于外周血。外周循环中受循环血量、心率、相关生化指标等的影响；也可能与我们标本收集只来源于我们医院(局限性)，对照组例数少有关。

Qian等[12]的研究发现，在发生心衰的整个过程中，miR-1非全程减少，在心衰发生的初始阶段，miR-1可轻微上调，而我们的降低结果是否时间点掌握不够？是否有必要进行连续观察？有待于我们后期研究进行完善。

通过miR-126和miR-1检测效能的分析，其灵敏度不够理想，但特异度相当，与cTnT，NTpro-BNP相比，无显著性差异；同时，cTnT，NTpro-BNP检测受峰值、采样时间点、NTpro-BNP半衰期、患者肾功能等因素影响就更加凸显出miR-126和miR-1检测的价值。而将其与NTpro-BNP，cTnT联合检测其灵敏度、特异度分别为69.3%和92.6%。但miR-126和miR-1 并非心衰患者1年内发生主要不良心脏事件的独立危险因子。

本次实验并未对心衰等级做划分(NYHA III&IV级)，今后我们的研究实验会在进一步增加健康对照的同时，注意标本收集后心衰的等级划分，充分利用循环miR-126，miR-1浓度的不同，对疾病进行尽量准确的诊断，指导临床治疗。

总之，miR-126，miR-1可用于心衰的诊断，但不能用于心衰病因的区分，且对患者1年的预后及不良事件预测无意义。

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