人TLR2胞外区基因酵母表达载体的构建及表达研究*

孙守勋，刘 静，解立威，柏雪婷，单 娜，孟冬娅

(1.中一东北国际医院临床检验中心，沈阳 110179；2.沈阳军区总医院检验科，沈阳 110003)

Toll样受体2(TLR2) 是目前已知的识别配体最多的Toll样受体，在人体内与脂多糖(LPS)发生反应，识别各种病原微生物后激活固有免疫应答，诱导T细胞分化成熟后启动适应性免疫应答[1～3]。TLR2的胞外区结构域是受体作用的重要功能区域，在TLR2参与的信号传导途径中发挥着组织和引导的重要作用，与TLR2的配体特异性密切相关，在其所介导的炎症反应中，其胞外区结构域是一个很有前景的炎性介质的阻断剂，因此具有潜在的抗炎治疗价值[4]，更是值得我们在不同层次上加以深入研究。本实验采用酵母双杂交系统，构建了TLR2胞外区基因的酵母表达载体，并转化酵母菌Y187对其进行表达，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1 材料与试剂 含有TLR2胞外区cDNA的重组质粒pAdTrack-TLR2由前期实验工作完成[3]。表达载体pGBKT7及酵母菌株Y187，酵母YPD培养基，SD/-Trp等培养基购自Clontech公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自美国Omega公司；pMD18-T载体，Taq酶，T4DNA连接酶，限制性内切酶EcoR I和Sal I为TakaRa公司产品；c-myc单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(HRP-IgG)购自北京中山生物公司；醋酸锂、半硫酸腺苷，IPTG，X-gal为Sigma产品；其余试剂为进口及国产分析纯，引物合成及DNA测序由上海英骏公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的扩增及序列测定：根据GenBank中人TLR2基因序列，设计一对扩增TLR2胞外区序列的引物，设计方法同笔者发表文献[5]，上游引物包含EcoR I的酶切位点(下划线表示)：5’-GCCGAATTCATGCCACATACTTTGTGGA TGGT-3’，下游引物包含Sal I的酶切位点(下划线表示)：5’-CGGGTCGACTCACATTAAGGGTACAGTCATCAG-3’，内含启动子ATG和终止密码子TCA。应用设计的引物，以质粒pAdTrack-TLR2为模板，建立PCR反应体系扩增目的基因，与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞中，经蓝白斑筛选后行测序鉴定，具体操作步骤同笔者发表文献[4]。

1.2.2 酵母表达质粒pGBKT7-TLR2的构建：构建的pMD18-TLR2质粒经测序鉴定后，酶切回收目的片段。用EcoRI和Sal I双酶切pGBKT7质粒使之线性化后，用T4DNA连接酶16℃过夜与目的片段连接，产物转化感受态DH5α，筛选阳性克隆。

1.2.3 重组质粒pGBKT7-TLR2转化酵母菌及自激活作用检测：按常规方法将酵母菌Y187制备成感受态，将构建正确的重组质粒pGBKT7-TLR2转化入酵母细胞Y187，具体操作按Clontech公司提供的说明书进行，转化后铺板于SD/-Trp/X-gal培养基进行筛选，观察转化菌的生长情况。

1.2.4 SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物：重组质粒转入Y187后在SD/-Trp/X-gal培养基上培养3天后，挑取白色、直径2～3 mm大小的菌落接种于SD/-Trp培养液中，30℃振荡过夜，再转入到50 ml YPD培养液中，继续振摇至A600达到0.5，离心收菌，按常规方法进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表达产物，同时以未转化的酵母菌株Y187作为空白对照。

2结果

2.1 PCR产物的分析及序列测定 取PCR产物经1 ml/dl琼脂糖凝胶电泳显示，扩增产物大小约为1 000 bp左右，同预期目的片段的大小符合，见图1。该片段经测序证实结果与GenBank中序列一致。

2.2 重组质粒pGBKT7-TLR2的鉴定 提取重组质粒pGBKT7-TLR2经EcoR I和Sal I双酶切鉴定，可见1 000 bp的目的片段条带，证明插入片段正确，重组质粒构建成功，见图2。

2.3 重组质粒转化酵母菌 我们选用的Y187菌株，在其转录调控区下游含有LacZ报告基因，其被激活后，在X-gal存在时，酵母菌克隆为蓝色。实验中当重组质粒转入Y187后在SD/-Trp/X-gal缺陷培养基上培养3天后，在平板上长出白色菌落，说明TLR2胞外区蛋白对酵母菌无毒性，同时也无自发激活LacZ报告基因的作用。

1：DNA marker DL2000；2：PCR扩增产物。

M：DNA marker DL2000；1：pGBKT7经EcoR I和Sal I双酶切；2：pGBKT7-TLR2经EcoR I和Sal I双酶切。

2.4 TLR2胞外区蛋白在酵母细胞中的表达检测 酵母细胞蛋白提取液经SDS-PAGE电泳和Western-blot检测TLR2胞外区蛋白的表达，在转入pGBKT7-TLR2的菌株中出现33KD的特异性目的条带，而未转化的Y187菌株杂交结果为阴性，见图3。

1：未转化的酵母细胞；2～4：转入pGBKT7-TLR2的酵母细胞。

3讨论目前，Toll样受体2(TLR2)在免疫应答各个环节中的功能和作用日渐引起研究者们的广泛关注，其胞外区与果蝇具有高度的同源性，是识别病原体的重要结构成分[6，7]，在TLR2介导的免疫防御反应中发挥重要作用，一直以来对于TLR2的研究包括其结构与功能，病原体识别的模式，信号传导途径等众多方面。已知在Toll样受体家族中，TLR2是表达范围最广、识别病原微生物及其产物种类最多的分子，它不仅可对病原相关分子模式(pathogen associated molecular paterns，PAMPs)进行识别、结合，并引发一系列的信号传导，导致炎症介质的释放，引起天然免疫防御，还能够介导对热休克蛋白等内源性抗原的识别，是联系天然免疫和获得性免疫的桥梁[8]。近年有学者发现，痤疮丙酸杆菌可以通过TLR2依赖的NF-kB途径调节机体的炎症及免疫反应，如果抑制TLR2的功能与表达，就有可能抑制痤疮的进展，研制出治疗痤疮的新型药物[9]。顾烨[10]的研究显示TLR2在子宫内膜异位症的发病和发展过程中起关键性作用。可见TLR2在免疫反应和许多疾病发展中扮演重要角色，对其在各个方面还有深入研究的意义。本实验正是采用酵母双杂交系统，构建了TLR2胞外区基因的酵母表达载体以进行后续的深入研究。

酵母双杂交技术与其他在体外检测蛋白间相互作用的方法相比具有快速、有效、便捷的优点，由于是在活细胞内进行实验，比其它体外试验更能够在某种程度上反映蛋白质在生理条件下的活性状态，该技术能够保持蛋白质间结构的完整性，提高反应的灵敏度和检测的精确度，实验结果可靠[11]。本实验首先扩增了TLR2胞外区基因，并将之克隆到酵母表达载体上，经测序及酶切验证无误，表明载体构建成功。但是酵母双杂交也有一定的缺陷性，目的蛋白在酵母菌株表达时有产生毒性的可能，引起假阴性，或可能直接激活报告基因而产生假阳性，排除这些影响因素将是目的蛋白能否在酵母系统中正确表达的关键[12]。本研究中构建的表达载体pGBKT7-TLR2转化到酵母菌Y187中，利用报告基因LacZ检测诱饵蛋白有无自激活作用，实验结果证明，转化的重组载体在SD/-Trp/X-gal平板中生长出白色克隆子，表明融合表达载体能在酵母中表达，无毒性和自激活作用，酵母细胞蛋白提取液经SDS-PAGE电泳和Western-blot检测TLR2胞外区蛋白能在酵母菌中稳定表达。综合以上，我们建立的目的基因蛋白表达系统，对深入了解TLR2胞外区蛋白的功能、生物活性及信号传导途径具有重要意义。

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