甲基苯丙胺对大鼠海马组织骨架肌动蛋白表达的影响

陈晓雷，狄莲，杨秀丽，李新新

（沈阳医学院法医司法鉴定所，辽宁 沈阳 110034）

中小剂量的甲基苯丙胺（MA）能够提高人的心境，使服用者清醒、精神振奋、机敏、兴致勃勃、思维活跃、情绪高涨、注意力集中、工作能力提高，而且可消除疼痛感、疲劳感、饥饿感。长期应用会出现躯体和精神依赖，导致其行为异常，甚至会影响患者的一生［1］。有研究报道MA依赖者其神经元骨架肌动蛋白结构发生改变［2］。本研究拟从影响神经元形态和功能的骨架肌动蛋白入手，研究MA依赖大鼠海马组织的肌动蛋白表达水平的变化，探讨MA类药物成瘾的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取健康雄性Wistar大鼠60只，体重（200±18）g，由沈阳医学院实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（辽）2012－0001。将大鼠随机分为实验组和对照组，其中实验组给予不同剂量的MA分别制作1周、2周、4周依赖模型组，每组10只；对照组分为相应的3组，并给予相同剂量的生理盐水。所有大鼠按分组分笼喂养，自由进食、饮水。

1.2 方法

1.2.1 给药方式 MA依赖1周组采用递增方式腹腔注射MA（美国Able Laboratories公司），MA递增剂量为0.5、1、2、8、10、15、20 mg/kg，依次逐日递增，每天给药2次（8：00、20：00），相应对照组大鼠每日腹腔注射同体积的生理盐水；染毒1周组进行造模评估后进行下一步实验。MA依赖2周组和4周组则按20 mg/（kg·d）继续给药1周和3周，各对照组在相应的给药周期给予相同剂量的生理盐水［3］，进行造模评估后进行下一步实验。

1.2.2 造模评估指标 大鼠刻板行为评分参照GHF-Dodd方法［4］进行评价。腹腔注射MA后每10 min评分一次。评分标准：0分，静止不动或几乎没有活动；1分，正常活动，偶尔有向前运动；2分，活动伴随反复向前探索；3分，继续向前探索；4分，重复抬头、摇头或旋转；5分，迅速摇头，旋转或摇头的背腹运动。以刻板行为评分≥2分以及刻板行为持续时间≥15 min，为造模成功。

1.2.3 提取蛋白及测定 将所有大鼠于最后一次给药5 h后断头处死，参照大鼠脑立体定位图谱对脑组织海马区进行分离［5］，并将脑组织置于液态氮中冷冻，于-80℃的条件下保存备用。将大鼠脑组织置于磷酸盐缓冲液中进行匀浆并提取所需蛋白。按常规提取D单体肌动蛋白（G-actin）、结合在微丝中的肌动蛋白（F-actin）和pcofilin。采用BradFord法进行蛋白浓度测定［6］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 G-actin表达比较 MA依赖1周、2周组和4周组的G-actin表达量与相应的对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 2组G-actin表达量比较（n=10，）

表1 2组G-actin表达量比较（n=10，）

组别实验组对照组t P 1周组99.7±5.3 100.3±4.8 3.565 0.066 2周组98.5±5.6 98.6±5.4 3.872 0.056 4周组97.6±4.5 98.5±4.7 3.468 0.055

2.2 F-actin表达比较 MA依赖1周组和2周组的F-actin表达量与相应对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），MA依赖4周组的F-actin表达量显著高于相应对照组（P＜0.05），见表2。

表2 2组F-actin表达量比较（n=10，）

4周组202.6±9.4 123.5±8.3 7.352 0.026组别实验组对照组t P 1周组103.5±3.8 104.2±3.9 3.685 0.062 2周组110.5±4.6 109.8±3.5 3.868 0.058

2.3 p-cofilin表达比较 MA依赖1周组的pcofilin表达量与相应对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），MA依赖2周组和4周组的p-cofilin表达量均显著高于相应对照组（P＜0.05），见表3。

表3 2组p-cofilin表达量比较（n=10，）

表3 2组p-cofilin表达量比较（n=10，）

组别实验组对照组t P 1周组109.6±6.8 108.9±4.5 3.736 0.060 2周组108.3±12.4 74.6±5.7 5.368 0.036 4周组116.2±9.2 73.4±6.8 6.352 0.030

3 讨论

MA的依赖能够导致机体的神经系统发生可塑性改变，会导致用药者出现身体和精神上的依赖。已有研究证实，这种依赖主要通过神经细胞骨架肌动蛋白的重构来实现的。而蛋白的重构直接体现在脑区的G-actin、F-actin和p-cofilin等蛋白含量的变化［7］。因此通过动物实验对MA对神经细胞骨架肌动蛋白重构的影响进行研究，对MA的临床应用及禁毒的研究均具有重要的价值［8］。

本研究以MA依赖1周、2周和4周的大鼠和对照组大鼠为研究对象，分别检测其海马区的G-actin、F-actin和p-cofilin等蛋白表达量，并按照染毒时间和相应的对照组进行比较，从而证实MA对大鼠神经细胞骨架肌动蛋白重构的影响。研究结果显示，MA依赖1周组的G-actin、F-actin和p-cofilin表达量与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；MA依赖2周组的G-actin、F-actin表达量与相应的对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），而p-cofilin表达量存在显著差异；MA依赖4周组的F-actin、p-cofilin表达量均显著高于对照组（P＜0.05），证实了MA对大鼠神经细胞骨架肌动蛋白重构的影响。本研究虽然为动物实验，与MA对人体神经细胞骨架肌动蛋白的重构存在一定的差异，但仍具有一定的参考价值。

综上所述，MA对大鼠神经细胞骨架肌动蛋白的重构具有影响，对药物的临床应用和研究具有参考价值。

［1］郑志军，李景业，韩松，等.不同依赖时间对甲基苯丙胺依赖者空间认知功能的影响［J］.中华行为医学与脑科学杂志，2014，23（8）：707-709.

［2］于亮.吗啡对大鼠神经细胞骨架肌动蛋白重构的影响及其机制探讨［D］.石家庄：河北医科大学，2010.

［3］陈晓雷，杨秀丽，王俊平，等.拟人参皂苷F11对甲基苯丙胺依赖大鼠的血清及脑组织中氧化物的影响［J］.华西药学杂志，2016，31（2）：152-153.

［4］ Sams-Dodd F.Phencyclidine-induced stereotyped behaviour and social isolation in rats：a possible animal model of schizophrenia［J］.Behav Pharmacol，1996，7（1）：3-23.

［5］诸葛启钏，叶盛，苏志鹏，等.大鼠脑立体定位图谱［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2005：64-135.

［6］Qian X，Dong H，Hu X，et al.Analysis of the interferences in quantitation of a site-specifically PEGylated exendin-4 analog by the Bradford method［J］.Anal Biochem，2014，465：50-52.

［7］ Toda S，Shen HW，Peters J，et al.Cocaine increases actin cycling： effects in the reinstatement model of drug seeking［J］.J Neurosci，2006，26（5）：1579-1587.

［8］闫彩珍，于亮，刘川，等.吗啡依赖大鼠不同脑区肌动蛋白及其结合蛋白的表达变化［J］.中国药理学通报，2011，27（8）：1143-1147.