PM2.5对COPD模型大鼠血清及肺泡灌洗液中髓过氧化物酶表达的影响

赵炎，宋楠，毛明清，李男，夏书月*

（1.沈阳医学院附属中心医院医院呼吸内科，辽宁 沈阳 110024；2.沈阳医学院研究生院2016级硕士研究生；3.沈阳医学院研究生院2015级硕士研究生）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以慢性气流受限为特征的缓慢进展、渐进性加重的肺部疾病，其主要病理特征是气道不完全、可逆性气流受限，而氧化应激与慢性炎症是造成COPD反复发作及进行性加重的两个重要因素［1-2］，慢性炎症中又以中性粒细胞在气管腔内大量聚集、活化、释放髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）及氧自由基等导致支气管肺组织损伤为主［3］。细颗粒物（PM2.5）可损害COPD患者单核源性巨噬细胞的吞噬功能，其机制可能与氧化损伤有关。本研究旨在通过观察COPD模型大鼠在PM2.5干预后血清及肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中MPO水平差异，探讨在PM2.5干预下MPO与COPD发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级2月龄雄性Wistar大鼠32只（购于辽宁生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001），体重160～180 g，常规饲养于沈阳医学院附属中心医院动物房。采用随机数字表法将32只大鼠分为对照组、PM2.5组、COPD对照组、COPD+PM2.5组，每组各8只。

1.2 主要仪器及试剂 烟熏机（AS 100香烟烟雾发生器）；黄果树牌香烟（贵州中烟工业有限责任公司生产，购于沈阳市），其中焦油含量为16 mg/支，烟气烟碱含量为1.2 mg/支；BALF及血清MPO ELISA试剂盒（上海活乐生物科技有限公司）；冷光源硬性内窥镜（外径2.7 mm，徐州科能光电设备有限公司）；沈阳市冬季（2016年11月至2017年4月）空气污染细颗粒物来源于沈阳市环境监测中心站制成混悬液（2 mg/ml）［4］。

1.3 方法

1.3.1 COPD模型的建立 参考Nie等［5］方法将COPD组大鼠置于烟熏机中，每次暴露香烟20支，每天2次，每次1 h，持续16周，根据肺组织病理结果确定COPD模型成功与否；COPD+PM2.5组：COPD造模同COPD组，造模成功后第1、3、5天，参照Zhao等［6］气管滴注的方法，利用冷光源气管插管气管滴注PM2.5混悬液（10 mg/kg），共3次；PM2.5组：与COPD+PM2.5组相同时间点（造模完成后第1、3、5天）利用冷光源气管插管气管滴注PM2.5混悬液（10 mg/kg），共3次；对照组给予等量的生理盐水气管滴注。

1.3.2 标本制作 在最后一次气管滴注完成24 h后将4组大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于实验动物台，剖开腹部，腹主动脉采血约5 ml，4℃，2 000 r/min，离心20 min，留取血清，置-80℃冰箱中保存待测。取血完成后，暴露气管，夹闭右肺，放留置针，用生理盐水行左全肺灌洗，每次2 ml，充分回收，反复灌洗3次，回收率大于2/3为灌洗成功，20℃，2 000 r/min，离心20 min，留取上清，置-80℃冰箱中保存。取大鼠右肺，置于0.1 mol/L多聚甲醛中固定，用于组织病理学分析。

1.3.3 ELISA法检测MPO的表达 采用ELISA法检测各组大鼠血清及BALF中MPO表达水平，按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织光镜下观察 与对照组相比，COPD组大鼠气道壁及平滑肌明显增厚，肺泡腔扩大、肺泡壁破裂融合及肺泡数减少更明显；PM2.5组大鼠气道壁及平滑肌增厚不明显，但黏膜下水肿、黏膜层断裂及气道上皮细胞脱落明显；COPD+PM2.5组大鼠气道壁及平滑肌增厚及肺泡腔扩大、肺泡壁破裂融合及肺泡数减少、黏膜下水肿，黏膜层断裂、气道上皮细胞脱落较COPD组、PM2.5组更明显，见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE染色结果（×40）

2.2 ELISA法检测血清及BALF中MPO表达水平 COPD组、PM2.5组和COPD+PM2.5组血清及BALF中MPO表达较对照组均增加（P＜0.01），且COPD+PM2.5组血清及BALF中MPO表达水平高于COPD组与PM2.5组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清及BALF中MPO的表达水平比较（）

表1 各组大鼠血清及BALF中MPO的表达水平比较（）

注：与对照组比较，1）P＜0.01；与 PM2.5 组比较，2）P＜0.05；与COPD组比较，3）P＜0.05

BALF中MPO值（U/L）21.37±1.38 56.54±4.621）62.78±3.231）102.32±4.821）2）3）189＜0.01组别对照组PM2.5组COPD组COPD+PM2.5组F值P值n6 6 6 6血清中MPO值（U/L）5.62±0.89 18.32±1.021）15.23±1.341）28.97±2.081）2）3）89.23＜0.01

3 讨论

2010年大气污染已居我国居民归因疾病负担第4位［7］，带来的人群健康问题受到广泛关注［8-10］。PM2.5一直是影响沈阳及其周边省市大气环境质量的首要污染物。PM2.5表面积大，粒径小，可在大气中长时间停留，且含有大量的有毒有害物质，可随着呼吸进入人体，到达肺泡与血液中。流行病学研究结果显示，在所有大气污染物中，PM2.5与呼吸系统疾病的相关性最强［11］。研究表明，PM2.5在100 μg/m3浓度范围内与健康危害程度呈线性关系，而且即使在很低的作用浓度下，PM2.5依然显示出一定的毒性，目前的研究并没有发现PM2.5的安全剂量［11］。故本研究通过环境检测中心站采集了沈阳地区的PM2.5制备混悬液，以COPD大鼠为研究模型，探讨PM2.5对COPD模型大鼠血清及BALF中MPO表达的影响。

MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶，主要存在于中性粒细胞中，MPO反映中性粒细胞的浸润情况，可作为中性粒细胞的活化标志物［12］，同时反映机体全身或局部炎症水平和氧化应激程度。

本实验通过制作COPD模型，给予COPD模型大鼠气管滴注PM2.5混悬液后，对大鼠血清及BALF中MPO表达水平的测定，结果发现，COPD组、PM2.5组、COPD+PM2.5组血清及BALF中MPO表达水平均高于相应的对照组（P＜0.01）。提示模型组气道内中性粒细胞脱颗粒释放过量的MPO等酶类和细胞因子，诱导了气道炎症和组织损伤。表明COPD时大量中性粒细胞在肺内聚集活化，脱颗粒释放过量的MPO等酶类和细胞因子，诱导气道炎症和组织损伤，与舒娟等［11］的研究结果一致，这可能是COPD慢性渐进性炎症的形成机制之一。

综上所述，PM2.5进入气道后，使得中性粒细胞分泌的MPO增加，MPO作为主要的炎症递质，促使COPD气管炎症的发生发展，最终导致气道结构的重塑和气流受限的进行性加重。

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