不同工龄的核从业人员血清早衰细胞因子BALP以及TRACP-5b的表达分析*

章莉 朱军 贺再清 陈敬 周静秋 陈丽娟

(核工业四一六医院核应急分队，四川 成都 610051)

日本Fukushima核事故之后，国际医生防止核战争联盟发表的《切尔诺贝利核灾难25年后的健康影响》中[1]的重要发现：核废清理者的非癌症疾病“早衰”远超过恶性肿瘤及白血病的发病率。而在这之前，恶性肿瘤与白血病则是辐射损伤发病的首位[5]。

辐射所致早衰的机制复杂，研究证实造血干细胞以及内皮细胞的损伤是辐射所致早衰的始动因素，通过应激介导的早衰(Stress-induced premature senescence，SIPS)激活p53-p21-pRb信号途径，多种细胞因子参与和表征了细胞衰老，从而发生器官及系统性的早衰[2-3]。造血细胞龛，是维持造血干细胞的生理功能重要的物质基础。动物实验发现[4]，造血细胞龛的损伤是辐射早衰的另一个重要机制，骨内膜龛中的成骨细胞以及与其作用相反的破骨细胞参与了辐射早衰的发生。骨特异性碱性磷酸酶(Serum bone alkaline phosphates，BALP)[7]，由成骨细胞产生，其变化可反映成骨细胞的活性；抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(Tartrate-resistant acid phosphatase isoform-5b，TRACP-5b)来源于破骨细胞，检测其外周血的变化，可以了解破骨细胞活性。

前瞻性观察不同工龄段的核从业人员的造血龛早衰细胞因子的变化，根据这些变化调整制定更完备的职业防护，核从业的职业防护是核安全具体实施是一重要内容。本研究拟观察核从业人员外周血BALP以及TRACP-5b的变化，了解造血细胞龛的功能。

1 临床资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 一般资料及分组

选取2015年9月至2016 年2月在我院体检的在川某核单位体检的核从业人员，共216人次作为研究对象。并以不同核从业工龄时间分为5组：即0～3年组，3～8年组，8～15年组，15～25年组，>25年组。同时选取非涉核正常体检41人次作为对照。

1.1.2 排除标准

a)染色体有畸变或微核者；b)BMI≥24；c)血清尿酸、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白超出实验室正常上限及下限的核从业人员； d)不愿接受研究或不能够依从研究要求的核从业人员。

1.1.3 主要试剂与仪器

SpectraMax©iD3型酶标仪(Molecular Devices公司，美国)；Aquamax2000洗板机(Molecular Devices公司，美国)；X-15R型台式高速离心机(贝克曼公司，美国)；人骨特异性碱性磷酸酶ELISA试剂盒(BIM Biosciences公司，美国)，人细胞间粘附分子-1ELISA试剂盒(BIM Biosciences公司，美国)。

1.2 方法

用不含抗凝剂的带有分离胶的真空采血管采集清晨(早晨6:00～8:00)空腹静脉血2-3 ml，25 ℃室温静置1～2 h，4000 rpm离心10 min，取血清分装至100 μl eppendorf管，于-80 ℃冰箱保存。血样从-80 ℃冰箱取出后，于25 ℃室温环境下自然解冻80 min。应用酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法测定血清BALP以及TRACP-5b的浓度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 研究对象的基本数据比较

216例核从业人员根据工龄分为“0～3年”组；“3～8年”；“8～15年”；“15～25年”；“>25年”共5组及正常对照组。各组例数，中位年龄，体重指数；淋巴细胞数；C反应蛋白；类风湿因子；球蛋白；红细胞沉降率，经统计分析，P>0.05，各组间基数无显著的统计学差异，见表1。

表1 研究对象的基本数据

2.2 血清骨特异性碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶5b的测定

不同工龄组与正常组BALP及TRACP-5b的表达采用方差分析，发现两者均P<0.05，表明组间存在显著差异。再通过LSD两两比较分析， 发现对于BALP值，工龄15～25年组比工龄0～3年组，3～8年组，8～15年组及正常对照组明显降低(P<0.05)；对于TRACP-5b值，工龄15～25年组比工龄0～3年组，3～8年组，>25年组及正常对照组明显升高(P<0.05)，见表2。

表2 不同工龄组的核从业人员的血清BALP以及TRACP-5b的表达

注：与15～25年组相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

3 讨论

多种应激原，包括电离辐射作用于机体，机体细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)增多，抗氧化系统失去稳态，以SIPS机制，激活细胞内p53-p21-pRb等多条信号通路，介导细胞早衰。动物研究证实[8]，衰老细胞具有衰老相关分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype,SASP)，会分泌出炎症性细胞因子影响周围细胞，加速周围组织细胞衰老，从而导致器官衰老相关表型的相继发生。国际医生防止核战争联盟关于切尔诺贝利的健康影响报告中指出，核废清理者骨骼系统的早衰增加了53倍，电离辐射对骨髓龛的损伤是其发生的原因[1]。成骨细胞是骨内膜龛的重要组成部分，破骨细胞的活性是与成骨细胞的活性相耦联的，因此，通过了解成骨细胞细胞与破骨细胞的活性可以了解骨髓龛的功能状态。

正常生理状态下，年龄增长55岁之后，外周血BALP表达渐减少；TRACP-5b表达增高[9]。本研究根据工龄将核从业人员分为五组的观察发现，在五组核从业人员间，随着工龄的增加，BALP的表达水平降低，而TRACP-5b而表达增加，这与非涉核正常人群体检结果一致。研究发现，随着年龄的增加，由于衰老细胞具有衰老相关分泌表型(SASP)，会分泌出炎症性细胞因子影响周围细胞，促进周围组织细胞的衰老并且会促进癌症的发生骨髓龛的活性逐渐减退，表现为成骨细胞功能减退[6]，破骨细胞的活性增强。本研究观察到的这一结果与相关研究所观察到的是一致的。

本研究还观察到，“15～25”年工龄的核从业人员组中，BALP是最低，TRACP-5b最高。“15～25年”工龄组的核从业人员，中位年龄为38岁，体重指数及淋巴细胞等实验室指标与其他组及对照组，没有明显差异。而BALP显著减低，TRAP-5b显著增高，这些细胞因子的变化提示其信号通路的上游的环节发生了变化。最近的研究表明，基因组的不稳定性在电离辐射等多种应激原导致衰老的过程中有重要作用，基因组的不稳定通过改变蛋白的质或量使其改变正常功能，促进了衰老表型的产生，导致组织稳态被打破等，继而出现细胞衰老至器官衰老的逐级发生。根据本研究所观察到的“15～25”年工龄的核从业人员组中，BALP是最低，TRACP-5b最高的这一结果，可以推测p53-p21-pRb信号通路上游的基因组存在不稳定性。因此，下一步的研究可以针对该年龄段的核从业人员进行追踪随访，重点关注骨关节系统早衰疾病的发生。为深入探讨辐射引起早衰的生物学机制提供相关的数据分析，也为建立更细化的职业防护依据有着极为现实的意义。

1 Cologne JB, Preston DL.Longevity of atomic-bomb survivors[J]. Lancet, 2000, 356(9226): 303-307.

2 VanDeursen JM. The role of senescent cells in ageing[J]. Nature, 2014, 509(7501): 439-446.

3 Thomas Kirkwood. Understanding the odd science of aging[J]. Cell, 2005, 120: 437-447.

4 Darren J Baker, Bennett G Childs, Matej Durik, et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan[J]. Nature, 2016, 530(7589): 184-189.

5 Wald Schmidt JG,Braunstein EM, Buckwalter KA. Magnetic resonance imaging of osteoarthritis[J]. Rheu Dis Clin North Am, 1999, 25(2): 451-456.

6 景鹏伟,胡文煦,宋小英,等. 衰老大鼠模型骨髓基质细胞的生物学特点[J]. 解剖学报, 2015, 46(1): 44-50.

7 Kim HJ, OhkB, Kang WY, et al. Deficiency of lipocalin-2 promotes proliferation and differentiation of osteoclast precursors via regulation of c-fms expression and nuclear factor-kappa B activation[J]. Bone Metab, 2016, 23(1): 8-15.

8 Miyamoto T. Role of osteoclasts in regulating hematopoietic stem and progenitorcells[J]. World J Orthop， 2013, 4(4): 198-206.

9 Mdndez-Ferrer S, Michurina TV, Ferraro F,et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche[J]. Nature, 2010, 466(7308): 829-834.