健胃愈脑汤改善脑缺血再灌注大鼠认知功能的实验研究

韩明亮 关运祥

1)许昌县人民医院中医科，河南 许昌 461000 2)河南中医药大学第一附属医院脑病区，河南 郑州 450000

脑部是人体中最为重要的之一，其对氧的敏感度不亚于其他任何组织器官。脑组织缺血是造成其他局部脑组织及功能障碍的重要前提，其损害程度与血流量和缺血时间有密切关系，短时间内的不完全缺血是可逆性损伤，长期的完全缺血甚至会造成脑水肿、脑梗死[1-4]。脑缺血再灌注模型是一种造成脑功能严重损伤的模型，此时，脑细胞生物电出现病理性慢波，在缺血一段时间后发生再灌注，慢波加强并持续不断，颞叶组织氨基酸代谢发生病理性变化，兴奋性氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸等水平逐渐降低，抑制性氨基酸如丙氨酸、甘氨酸等水平显著升高，随着缺血时间的延长，脑组织细胞微结构更加明显，核染色质聚集，线粒体、内质网肿胀，钙盐沉积，血管内血栓、髓鞘变性、分层，周围间隙涌入水肿液，脑部呈不可逆伤害，这也是阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)等神经性疾病发生的病理基础[5-8]。本研究对健胃愈脑汤在改善脑缺血再灌注大鼠的认知功能进行相关研究。

1 资料与方法

1．1材料

1．1．1 动物：选取30只成年雄性SD大鼠(来源于江苏省南京市亚东实验动物研究中心)为研究对象，体质量250～300(276.3±12.4)g。随机分为健胃愈脑汤组、对照组和假手术组各10只，3组体质量、性别等无显著差异(P>0.05)，具有可比性。

1．1．2 药品与试剂：健胃愈脑汤(由本院自行协定制作)，药方：党参6 g，白术10 g，半夏10 g，陈皮15 g，茯神10 g，神曲10 g，枣仁10 g，红景天10 g，天麻10 g，甘草6 g。BDNF一抗(生产批号E-30664)、二抗(生产批号：970502)由sigma公司提供；RIPA裂解液(生产批号P0013)：50 mmol/L Tris-HCl (pH值7.4)，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，由北京索莱宝科技有限公司提供。

1．1．3 仪器：Morris水迷宫系统(型号BW-MWM101，正华生物仪器有限公司)；凝胶成像仪(型号UVCI-01，香港驰冉有限公司)。

1．2治疗方法

1．2．1 制备动物模型：大鼠术前禁食12 h，可自由饮水，再制作夹闭双侧颈总动脉合并低血压全脑缺血再灌注模型。腹腔注射水合氯醛对大鼠进行麻醉，注射量400 mg/kg，分离出双侧颈总动脉和右侧颈总静脉，静脉插管并输注200 mL肝素化生理盐水，抽取30%大鼠血总容量的血液，夹闭左右颈总动脉，20 min后缓慢输回血液，缝合伤口[9-11]。

1．2．2 给药：假手术组大鼠仅分离出总动脉和总静脉，对照组大鼠和健胃愈脑汤组建立脑缺血再灌注模型，健胃愈脑汤组大鼠术后1 d灌服生理盐水稀释的健胃愈脑汤，浓度10 g/L，1次/d，100 mg/(kg·次)，持续灌服2周。假手术组和对照组大鼠用等体积的生理盐水灌胃。研究完成后处死大鼠[12-13]。

1．2．3 水迷宫实验：术后第21～25天行Morris水迷宫(MWM)检查，评估大鼠认知功能的变化。MWM直径200 cm，高50 cm，含直径15 cm的圆台，蓄水面高于圆台1 cm。将大鼠于实验前训练1 d，实验时放大鼠于圆台上提前适应5 min，放水使其游泳至平台，2 min内未发现平台的大鼠引至平台再停留0.5 min并终止实验。实验2～3 d后放大鼠分别从不同象限入水训练，潜伏期超过2 min按2 min算，实验5 d后撤出圆台，随机选择某象限放大鼠入水，对实验全过程进行监控，记录大鼠潜伏期、平台穿越次数和象限滞留时间[14-16]。

1．2．4 Western Blot检测：术后第26天行Western blot检查海马区脑源性神经营养因子(BDNF)表达及基因表达。模型建造7 d后提取大鼠新鲜脑组织经裂解分离全蛋白，采用BCA法测定目标蛋白浓度，经电泳、转膜和封闭等过程后加入BDNF和一抗(1：1 500)，维持温度5 ℃，过夜孵育，加入二抗，维持稳度为37 ℃，2 h孵育，采用凝胶成像系统成像，分析BDNF和基因表达情况[17-19]。

1．2．5 Real time-PCR检测：BDNF mRNA扩增采用RT-PCR法，引物由上海迪奥生物公司合成。引物序列为：上游5'-TGAAAGAAGCAAACGTC-CACG-3'；下游5'-TGTTTGCGGCATCCAGGTA-3'。GADPH(内参基因)：上游5'-CCCCACACACATGCACTTACC-3'；下游5'-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3'。扩增之前先提取总的RNA，再通过RT-PCR反应体系对基因进行扩增，观察凝胶电泳成像结果[20-22]。

2 结果

2．1认知能力迷宫实验中，随着大鼠训练时间的延长，潜伏期时间缩短，与假手术组相比，对照组潜伏期时间明显增长(P<0.05)，大鼠空间学习能力受损严重；与对照组相比，健胃愈脑汤组潜伏期时间明显缩短(P<0.05)，大鼠空间学习能力明显恢复(表1)。此外，健胃愈脑汤组大鼠在目标象限停留时间和圆台穿越次数明显多于对照组(P<0.05)，说明大鼠空间记忆能力得到显著改善(表2)。

表1 3组大鼠潜伏期平均时间±s，s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

表2 3组目标象限停滞时间及圆台穿越次数比较±s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

2．2 3组BDNF mRNA表达情况对照组与假手术组BDNF mRNA比较明显下降(P<0.05)，健胃愈脑汤组与对照组BDNF mRNA明显升高(P<0.05，图1)。

图1 3组大鼠BDNF mRNA的表达

2．3 3组BDNF的蛋白表达情况对照组与假手术组BDNF 蛋白比较明显下降(P<0.05)，健胃愈脑汤组与对照组BDNF蛋白明显升高(P<0.05，图1、表2)。

图2 Western blot 蛋白的表达

图3 3组大鼠BDNF蛋白的表达

3 讨论

脑源性神经营养因子(brain derived neurotro-phic factor，BDNF)广泛分布于中枢神经系统，在神经元的生长分化过程中起到十分重要的作用，可防止神经元受损，改善其病理状态，是维持中枢及周围神经系统神经元正常生理功能的必要性因素[23-26]。研究表明，BDNF在调节患者痛苦和恐惧中也有重要功能，可稳定创伤后压力紊乱，覆盖痛苦记忆，重建信心和安全感，现已作为“忘忧药”使用并取得成功[27-31]。健胃愈脑汤通过上调体内BDNF水平，达到缓解焦虑，促进神经元自我恢复的作用，其作用机制可能与药方中红景天、党参、神曲等神经保护功能有关，诱导神经细胞的再生和分化，促进脑功能的恢复[32-38]。

中医认为，人至老年，由于劳倦过度，饮食不节，会导致久病体虚，脾胃亏虚，运化失司，水液代谢障碍，水津停滞，易致痰阻脑络，或气虚不能运血，血液瘀滞脑络；气、血、痰、瘀诸邪内阻，上扰清窍，造成老年人精血亏损，脑髓空虚，元气不足，阴阳失调。简而言之，老年人易胃气亏虚为本，痰瘀犯脑为标，痰瘀阻滞、脑神失聪导致AD的发生[39-42]。结合中医辨证理论及现代医学研究理论而制定的治疗气血亏虚型阿尔茨海默病的有效方剂健胃愈脑汤可明显改善这一症状，Morris水迷宫实验证明大鼠的学习能力、空间记忆能力和认知能力得到明显的改善[43-46]。与假手术组相比，对照组潜伏期时间明显增长(P<0.05)，因对照组经脑缺血再灌注模型建立后，脑部血流量减少，供氧能力减弱，脑部机能遭破坏，尤其是大鼠空间学习能力受损严重；与对照组相比，健胃愈脑汤组大鼠脑部功能恢复较好，学习能力增强，潜伏期时间明显缩短(P<0.05)，大鼠空间学习能力明显恢复[47-50]。此外，健胃愈脑汤组大鼠在目标象限停留时间和圆台穿越次数明显多于对照组(P<0.05)，说明通过健胃愈脑汤治疗后的大鼠对圆台的空间位置记忆十分清楚，因而穿越次数明显增多，反映其空间记忆能力得到显著改善。对照组相对于假手术组BNDF mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)，说明手术模型成功。BNDF mRNA和蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)，说明增加了BNDF的表达[51-55]。本研究表明，健胃愈脑汤通过提高BNDF的表达而改善脑缺血再灌注大鼠的认知功能，促进脑损伤的恢复，但其药理、药效机制仍需进一步探讨。

[1] 孟馨，李元涛，胡薇，等．七氟醚分娩镇痛对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织中c-fos表达的影响[J]．新乡医学院学报，2017，34(1)：26-28．

[2] 孙向峰，侯梅，苑爱云，等．丰富环境对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠学习记忆、海马区脑源性神经生长因子和突触素蛋白表达的影响[J]．中华实用儿科临床杂志，2015，32(4)：296-299．

[3] 曹勇军，程彦斌．线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的改进与探讨[J]．中国应用生理学杂志，2001，17(2)：198-200．

[4] 王淑君，王万铁，熊建华，邱晓晓，金可可．红花注射液对脑缺血-再灌注损伤家兔血浆TXA2/PGI2水平的影响[J]．中国现代应用药学，2003，20(2)：100-102．

[5] 刘震乾，张清秀，魏秀娥，等．小鼠脑缺血再灌注模型的优化及其效果评价[J]．东南大学学报(医学版)，2017，36(3)：328-332．

[6] 范婧婧，段满林．鼠类全脑缺血/再灌注模型研究进展[J]．国际麻醉学与复苏杂志，2017，38(2)：190-192．

[7] 李鹏飞．川芎嗪抑制脑缺血再灌注损伤的分子机制研究[C]．中华中医药学会免疫学分会第二次学术交流会暨中华中医药学会免疫学分会青年委员会成立大会论文集，2016：38-39．

[8] 侯昆，戴海龙，肖志成．脑缺血再灌注损伤研究进展[J]．中国心血管病研究，2016，14(1)：10-14．

[9] 郭东艳，范妤，赵晓平，等．健脑益智胶囊不同纯化工艺对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织炎症反应的影响[J]．中国老年学杂志，2015，35(3)：538-540．

[10] 吴明娟，孙晓伟，高延宏，等．头针联合川芎嗪对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织MyD88和皮层神经元损伤的影响[J]．中医药学报，2017，45(5)：52-56．

[11] 王金鑫，卢国彦，郭虹，等．心脑舒通胶囊对蒙古沙鼠全脑缺血再灌注损伤模型的神经保护作用[J]．中国临床药理学杂志，2017，33(6)：518-521．

[12] 魏伟，吴希美，李元建．药理实验方法学[M]．4版．北京：人民卫生出版社，2010：998．

[13] 陈奇．中药药理研究方法学[M]．3版．北京：人民卫生出版社，2011：159-160．

[14] 马素亚，郑俊超，畅洪昇，等．锁阳乙酸乙酯提取物改善慢性应激小鼠认知功能障碍的神经保护机制[J]．天然产物研究与开发，2017，29(8)：1 302-1 309．

[15] 任峰，魏海婷，刘琳琳，等．七氟醚诱发老龄大鼠认知功能的改变与TLR4-MyD88信号通路的关系[J]．中华神经医学杂志，2017，16(9)：919-923．

[16] 张漫，吕洋，杨文秀，等．脂多糖LPS诱导的神经炎症对小鼠认知功能的影响及相关机制分析[J]．基因组学与应用生物学，2017，36(4)：1 361-1 367．

[17] 杨敬华，刘秋芳，巫生文，等．镧影响大鼠海马CaMKIV、CREB磷酸化和bdnf基因表达的研究[J]．毒理学杂志，2017，24(4)：263-267．

[18] 王德山，王哲，王守岩，等．脑缺血再灌注损伤后不同时间点施眼针对大鼠海马组织bdnf表达的影响[J]．中国中医基础医学杂志，2012，18(2)：200-202．

[19] 王灿，方晓艳，徐坤，等．毛冬青总黄酮对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的影响[J]．中药药理与临床，2017，33(2)：70-74．

[20] 何筑，况时祥，张树森，等．脑通汤对缺氧-复氧大鼠海马神经元BDNF mRNA表达的影响[J]．贵阳医学院学报，2013，40(12)：1 306-1 310．

[21] 严艾，高进，陈萍．丙泊酚对新生大鼠海马Bdnf mRNA、proBDNF/mBDNF表达的影响及其与学习记忆功能的关系[J]．解放军医学杂志，2016，41(5)：389-394．

[22] 刘婷婷．莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马CyclinD1及Cdk6的影响[C]．第六届中国药理学会补益药药理专业委员会学术研讨会论文集．2016：34-34．

[23] 刘前君，李文强，徐光燕，等．前列地尔对缺血性脑卒中的疗效及对脑源性神经营养因子和基质金属蛋白酶9的影响[J]．中国实用神经疾病杂志，2013，16(24)：13-16．

[24] 冀翔宇，刘然，王世端，等．短暂性脑缺血再灌注损伤对老年大鼠神经功能的影响及其机制[J]．中华实验外科杂志，2015，32(2)：352-355．

[25] 喻斌，蒋宝平，阮鸣．川芎嗪和不同剂量冰片配伍对全脑缺血/再灌注大鼠脑区特异性保护作用研究[J]．中国药理学通报，2017，33(4)：589-591．

[26] 颜娟，郑茂东，崔玉环，等．大黄酚脂质体对脑缺血再灌注损伤小鼠体内抗氧化作用的影响[J]．中国老年学杂志，2018，38(3)：703-704．

[27] 俞陈陈，胡涵，汪小丹，等．姜黄素对自发性高血压大鼠脑缺血/再灌注后海马神经元损伤及RANTES表达的影响[J]．中国应用生理学杂志，2014，30(4)：360-364．

[28] 李蓉，李振华，谌贝贝，等．黄芩苷对全脑缺血/再灌注大鼠海马神经干细胞增殖和认知功能的影响[J]．中国老年学杂志，2015，35(9)：2 322-2 324．

[29] 刘文明，蔡晓旭，赫天辉，等．小鼠脑缺血-再灌注损伤中神经细胞BCL2及p-JNK2的表达[J]．宁夏医科大学学报，2016，38(2)：148-150，168，封4．

[30] 付浩，胡文静，王志宏，等．脑缺血再灌注小鼠线粒体DNA拷贝数与神经功能损伤相关性研究[J]．现代中西医结合杂志，2017，26(1)：4-6，13．

[31] 刘庆杰，王伟，白宏英．硫辛酸对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[J]．中国实用神经疾病杂志，2018，21(4)：357-360．

[32] 赵玲，赵红斌，秦文，等．cAMP/Ca2+信号通路在红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化中的作用和机制[J]．生物医学工程学杂志，2015，34(3)：401-408．

[33] 廖国平，邓芳文，孙德贵，等．红景天苷对局灶性缺血-再灌注损伤后神经细胞凋亡及对Bax、Bcl-2的影响[J]．海峡药学，2016，28(4)：33-37．

[34] LIU J H，BAO Y M，SONG J J，et al．Codonopsis pilosula(Franch)Nannftotal alkaloids potentiate neurite outgrowth induced by nerve growth factor in PC12 cells[J]．Acta Pharmacologica Sinica，2003，24(9)：913-917．

[35] 姚黄．越鞠升降汤联合盐酸帕罗西汀片治疗脑血管病后抑郁39例[J]．海峡药学，2016，29(12)：33-34．

[36] 王新蕾，龙艳芳，唐兴江．普罗布考预处理对高脂血症大鼠脑缺血再灌注后APE/Ref-1表达的影响[J]．医学理论与实践，2018，31(1)：1-2，5．

[37] 李媛，吴增，靳晓飞，等．黄芪甲苷对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的影响[J]．中国药理学通报，2018，34(1)：108-112．

[38] 孙波，蔡鑫君，吴婷婷，等．红花提取液对小鼠缺血再灌注脑损伤保护作用的实验研究[J]．中国中医药科技，2018，25(2)：205-207．

[39] 李帅，袁晓霞，于福鑫，等．老年性痴呆中医证候要素及分布规律[J]．辽宁中医杂志，2014，29(12)：1 888-1 891．

[40] 侯江淇，郭蕾，张俊龙．阿尔茨海默病中医辨治探析[J]．辽宁中医杂志，2017，44(2)：262-264．

[41] 梁丽贞，王俊，严永兴，等．microRNA-320对小鼠脑缺血-再灌注损伤的调控作用及其机制研究[J]．中华急诊医学杂志，2018，27(3)：313-317．

[42] 王梅，胡晓彤，戚大石，等．脑缺血/再灌注通过神经性一氧化氮合酶诱导KA受体亚基GluR6巯基亚硝基化的研究[J]．中国当代医药，2016，23(27)：149-152．

[43] 李蓉，李振华，杨俊卿，等．黄芩苷对全脑缺血/再灌注大鼠认知功能的影响及其机制研究[J]．中国药理学通报，2015，31(6)：80．

[44] 王玉，秦新月，张融融，等．RNA干扰RGMa对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质血管再生的影响[J]．第二军医大学学报，2016，37(4)：441-445．

[45] 王一超．Akt和mTOR在脑缺血再灌注大鼠皮质区的表达[J]．华北理工大学学报(医学版)，2017，19(1)：9-14．

[46] 孙竹梅，赵雅宁，李建民，等．不同强度运动预处理对全脑缺血再灌注大鼠生长相关蛋白-43、轴突生长抑制因子Nogo-A表达的影响[J]．解剖学杂志，2018，41(1)：40-44．

[47] 王树，张海红，薛贵平．大黄素对脑缺血-再灌注小鼠探索认知功能的改善作用[J]．神经药理学报，2013，3(4)：8-13．

[48] LU C，HA T，WANG X，et al．The TLR9 ligand，CpG-ODN，induces protection against cerebral ischemia/reperfusion injury via activation of PI3K/Akt signaling[J]．J Am Heart Assoc，2014，3(2)：e000 629．

[49] DONG H，WANG S，ZHANG Z，et al．The effect of mitochondrial calcium uniporter opener spermine on diazoxide against focal cerebral ischemia--reperfusion injury in rats．J Stroke Cerebrovasc Dis[J]．2014，23(2)：303-309．

[50] LIN H，CHENG C F．Activating transcription factor 3，an early cellular adaptive responder in ischemia/reperfusion-induced injury[J]．Ci Ji Yi Xue Za Zhi，2018，30(2)：61-65．

[51] 吴欢茹，韩岚，彭代银，等．脑缺血再灌注大鼠海马区神经营养因子的表达及桃红四物汤的干预[J]．安徽中医药大学学报，2017，36(5)：56-61．

[52] ABDEL-LATIF R G，HEEBA G H，TAYE A，et al．Lixisenatide ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury via GLP-1 receptor dependent/independent pathways[J]．Eur J Pharmacol，2018 Jun 1．pii：S0014-2999(18)30315-7．

[53] ZHAO H，LUO Y，CHEN L，et al．Sirt3 inhibits cerebral ischemia-reperfusion injury through normalizing Wnt/Β-catenin pathway and blocking mitochondrial fission[J]．SIRT3 Wnt/Β-catenin．Cell Stress Chaperones，2018 Jun 3．

[54] CUI C，YU F，YIN S，et al．Remifentanil Precondition-ing Attenuates Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Rats via Neuronal Activation in Dorsal Vagal Complex[J]．Mediators Inflamm，2018，2018：3 260 256．

[55] WANG C，LIU C，WANG M，et al．UPLC-HRMS-Based Plasma Metabolomic Profiling of Novel Biomarkers by Treatment with KDZI in Cerebral Ischemia Reperfusion Rats[J]．Molecules，2018，23(6)．pii：E1315．