消渴蛋白Ⅰ号颗粒制备工艺优化及质量标准的建立

初洪波，成光宇，于秀华

（长春中医药大学附属医院，长春 130021）

消渴蛋白 Ⅰ 号为国家级名中医南征教授应用解毒通络保肾法治疗消渴肾病（糖尿病肾病）的经验方[1-13]。糖尿病肾病是一种严重的糖尿病并发症，是以肾小球硬化为特征的继发性肾脏疾病，其临床表现为肾功能进行性损害、高血压、水肿、蛋白尿，是终末期肾衰的主要原因，糖尿病肾病的中医辨证的病机关键是毒损肾络。消渴蛋白Ⅰ 号临床应用20余年，临床病例达到三千多例，经临床研究证实其可消除蛋白尿症状，在良好的临床疗效基础上，拟进行院内制剂开发。

1 材料与仪器

JH2102电子天平（上海精密科学仪器有限公司），ZY-TS-NS-100多功能提取浓缩装置（上海紫裕生物科技有限公司），DZF型真空干燥箱（上海博迅），WCH-10小型混合槽（潍坊市北方制药设备有限公司），小型摇摆式颗粒机（上海天和制药机械厂），CAMAG型薄层色谱成像仪（瑞士CAMAG公司）。试剂均为分析纯； 五倍子对照药材（批号121078-201312），丹酚酸B对照品（批号111562-201110），丹参对照药材（批号120923-201113），陈皮对照药材（批号120969-201211）以上对照药材及对照品均购于中国食品药品检定研究院；硅胶G、硅胶GF254薄层板为青岛海洋化工厂分厂生产；消渴蛋白Ⅰ号颗粒小试样品1、样品2、样品3，批号分别为： 20160801、20160802、20160803，均由长春中医药大学附属医院实验中心提供。

2 处方及制备工艺［14-24］

2.1 处方 白蔻仁、覆盆子、络石藤、五倍子、蝉蜕、白僵蚕、陈皮、丹参、党参、黄芪、黄精、土茯苓、白茅根。

2.2 制备工艺 以上14味，煎煮3次，每次2 h，加水量为8倍。煎煮液滤过，合并滤液，滤液浓缩稠膏（80 ℃时测定相对密度为1.20～1.25），按乳糖-稠膏2:1加入辅料，小型混合槽混匀，小型摇摆式颗粒机制成颗粒，80 ℃干燥，整粒，制成1 000 g，分装，即得。

2.3 水提最佳工艺的建立 据文献报道，药材主要活性成分为水溶性，结合本处方作为汤剂在临床应用多年，疗效确切的实际情况，采用水煎煮法对其进行提取。根据经验，确定影响提取效果的有3个主要因素，即A：煎煮时每次加水量；B：煎煮时间；C：煎煮次数。结合实际情况，为每个因素确定了3个水平，采用正交试验优化提取工艺条件。以出膏率作为正交试验的考察指标，对主要影响因素（加水量、煎煮时间、煎煮次数），进行三因素三水平L9（34）正交试验设计（见表1），以筛选最佳工艺。

表1 L9（34）正交试验因素及水平

试验方法：按处方比例称取白蔻仁等14味药材（总质量62 g），按表2方案进行试验，以出膏率为指标进行分析，结果见表2、表3。出膏率（%）=提取物质量（g）/62×100%

表2 L9（34）正交试验安排及结果分析

表3 方差分析表

通过方差分析（见表3）和直观分析（见表2）可知，A因素（加水量）、B因素（提取时间）无显著性，C因素（提取次数）有显著性（＜0.05）。各因素与水平的组合应为A2B3C3。确定最佳提取工艺为：煎煮3次，时间为每次2 h，加水量为药材量的8倍。

表4 水提取工艺的验证试验

结果可见，按此工艺，出膏率稳定，确定最佳工艺为A2B3C3，即加水煎煮3次，每次2 h，加水量为8倍。2.4 消渴蛋白Ⅰ号颗粒的成型工艺研究

2.4.1 稠膏的制备 处方药材按优化的最佳提取条件提取后，滤过，合并滤液，浓缩至稠膏（80 ℃时测定相对密度为1.20～1.25）。

2.4.2 辅料的选择 加入麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉做为制粒辅料，辅料与稠膏的比例为2:1，制粒时软材情况与辅料种类的关系，见表5。

表5 制粒辅料选择的考察

通过以上研究，确定本制剂采用乳糖做为辅料。2.4.3 颗粒干燥温度的选择 选用不同温度，干燥时间为6 h，对颗粒的干燥条件进行了考察，观察颗粒的干燥情况，并测定水分，结果见表6。

表6 湿颗粒干燥温度试验

结果可见，60 ℃条件下干燥6 h，其水分含量超出药典要求；而70 ℃干燥，水分稍高，接近限度值，故选择80 ℃为颗粒干燥温度。

2.5 颗粒的流动性考察 取制粒后的颗粒，以休止角作为流动性评价指标，考察颗粒的流动性。物料休止角平均为34.4°，表明物料流动性较好。

2.6 颗粒吸湿性的考察 一般条件下，药品生产车间GMP要求的相对湿度为45%～65%，为了考察生产条件下颗粒的吸湿性，并计算吸湿率。

经测定，20 ℃恒温放置48 h，颗粒的吸湿率为4.6%，表明本品吸湿不是很强。因此，颗粒在干燥后，应控制相对湿度小于65.0%的条件下进行包装，并采取防潮效果好的铝塑复合膜包装，可以控制产品含水量。2.7 包装材料 为保证药物的稳定性，制剂的内包材选择铝塑复合膜。

经过3批样品加速条件下6个月的稳定性考察及正常条件下24个月的稳定性考察，产品稳定性良好，说明制剂与内包材兼容性较好。

3 消渴蛋白Ⅰ号颗粒质量标准研究[25-38]

3.1 性状 对多批样品的颜色，气、味综合观察，最后确定本品的性状为：本品为黄色至棕黄色的颗粒；味苦，微甜。

3.2 鉴别

3.2.1 处方中五倍子的薄层鉴别 五倍子主要有效成分为五倍子鞣质，含量约为60%～70%，甚至高达80%；没食子酸2%～4%，树脂、蜡质等。供试品溶液的制备方法：取渴蛋白Ⅰ号颗粒20 g，研成细粉，加20 mL甲醇，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解；对照药材溶液的制备方法：按供试品溶液的制备方法将五倍子对照药材0.5 g，加甲醇10 mL制成对照药材溶液；对照品溶液制备方法：取没食子酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液。阴性对照液制备方法：按处方和制法制备不含五倍子的阴性样品、按供试品溶液制备方法制成阴性对照液。分别吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上。展开剂：环己烷-甲酸乙酯-甲酸（10:10:1）。显色剂和显色方法：置于紫外光灯（254 nm）下检视。层析结果见图1。

图1 五倍子薄层鉴别

3.2.2 处方中丹参的薄层鉴别 供试品溶液的制备方法：取渴蛋白Ⅰ号颗粒20 g，研成细粉，加25 mL 75%甲醇超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水100 mL使溶解，滤过，通过内径为2 cm，柱高为15 cm 的D101型大孔吸附树脂柱，弃去200 mL水洗脱液，收集200 mL70%乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解。阴性对照液制备方法：按处方和制法制备不含丹参阴性样品，按供试品溶液制备方法制成不含丹参的阴性对照溶液。对照药材溶液的制备方法：按供试品溶液的制备方法将丹参对照药材1 g制成对照药材溶液。对照品溶液制备方法：取丹酚酸B对照品，加75%甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上。展开剂：甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:3:4:0.5:2）。显色剂和显色方法：置紫外光灯（254 nm）下检视。层析结果见图2。

图2 丹参薄层鉴别

3.2.3 处方中陈皮的薄层鉴别 供试品溶液的制备方法：渴蛋白Ⅰ号颗粒20 g，研成细粉，加50 mL乙酸乙酯超声处理30 min，滤过，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解。阴性对照液制备方法：按处方和制法制备不含陈皮的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成不含陈皮的阴性对照溶液。对照药材溶液的制备方法：按供试品溶液的制备方法将陈皮对照药材1 g制成对照药材溶液。对照品溶液制备方法：取橙皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上。展开剂和展开方式：乙酸乙酯-甲醇-水（100:17:13）为展开剂，展至约3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20:10:1:1）的上层溶液为展开剂，展至约8 cm，取出，晾干。显色剂和显色方法：喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（365 nm）下检视。层析结果见图3。

图3 陈皮薄层鉴别

3.3 检查 按颗粒剂项下的要求（收载于中国药典2015年版四部通则0104），检查渴蛋白Ⅰ号颗粒3批样品（批号20160801、20160802、20160803）的装量差异、溶化性、粒度、水分、微生物限度、重金属及砷盐。

4 小结

消渴蛋白Ⅰ号颗粒选择了可溶性淀粉作为辅料，颗粒呈黄褐色、微甜、颗粒成型、溶化性好，方便了患者的服用。本文确定了最佳工艺条件和质量控制标准。

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