长柄侧耳发酵物对乙醇诱导小鼠胃溃疡的保护作用研究

王淑敏，曹 菁，穆双双，王 方，祝恩智

（长春中医药大学，长春 130117）

急性酒精性胃黏膜损伤，是指由于大量酗酒及饮用高浓度酒而引起以急性胃黏膜糜烂或浅表性溃疡为特征的急性胃黏膜浅表性损害，是急性胃黏膜损伤较常见的一种类型。经口摄入酒精可直接损害胃黏膜上皮的脂蛋白层，使胃黏膜屏障受损，加上胃液中氢离子回渗入黏膜上皮细胞，导致组胺、5-羟色胺和肝素释放，引起黏膜下动脉短路，毛细血管压力升高与通透性增加，最终出现黏膜充血、红细胞渗出、胃黏膜糜烂出血，甚至浅表性溃疡。

长柄侧耳（Pleurtus Spodotecus Fr.），又名灰白侧耳、匙形侧耳、灰冻菌。属担子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目（Agaricales）侧耳科（Pleurotaceae）的真菌，主要分布于吉林、云南、贵州、西藏等地，是一种常见的食药用菌[1]。侧耳属真菌肉质细腻，味鲜可口，营养丰富。60年代后，人们发现侧耳多糖具有多种功效，它能控制细胞分裂，调节细胞生长和衰老，可作为免疫促进剂,对肿瘤、心血管疾病和肝炎具有治疗作用，从而引起人们的重视[2]。现代研究表明，侧耳属真菌具有较好的提高机体免疫力、降血脂、降血压、抗肿瘤及抗氧化等作用[3]。本文主要研究长柄侧耳发酵物对乙醇诱导小鼠胃溃疡的保护作用，为长柄侧耳的开发利用提供科学依据。

1 实验材料

奥美拉唑（苏州中化药品工业有限公司）；长柄侧耳发酵物由长春中医药大学药用真菌研究室提供。ICR小鼠，22～25 g；许可证号：SCXK（苏）2012-0004；合格证编号：NO.201401547扬州大学比较医学中心。乙醇购自于南京海普乐生物有限公司，髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、IL-6、TNF-α、JnK 抗体、ErK抗体、p38抗体、NF-ĸBp65抗体等试剂盒购自南京建成生物有限公司。酶标仪（KX-21，美国SYSMEX）。

2 实验方法

2.1 小鼠酒精性胃溃疡模型复制及分组 取小鼠50只，随机分成5组：空白对照组（腹腔注射生理盐水）；乙醇组（灌胃无水乙醇，0.2 mL/只），奥美拉唑组（灌胃乙醇前1 h给予药物，0.5 g/kg），长柄侧耳发酵物低剂量组（灌胃乙醇前1 h给予药物，0.5 g/kg），长柄侧耳发酵物高剂量组（灌胃乙醇前1 h给药物，1 g/kg），每组10只小鼠。灌胃乙醇或生理盐水后4 h结束实验，取血清及胃组织测定各项指标。

2.2 指标检测

2.2.1 血清中MPO、SOD、MDA含量测定 按照试剂盒说明书进行测定。

2.2.2 胃病理学检查 切取胃，以4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察胃组织病理学改变。

2.2.3 血清中IL-6、TNF-α检测 按照试剂盒方法进行检测。

2.2.4 Western blot 将胃组织置于冰冷的裂解液收集裂解物总蛋白，组织蛋白行SDS-PAGE并转印至PVDF膜；室温封闭2 h，分别与JnK抗体、ErK抗体、P38抗体、NF-ĸBP65抗体一抗孵育，膜经漂洗后再与辣根过氧化物酶偶联的二抗反应，增强化学发光法（ECL）发光试剂显影，灰度成像软件（UVP，UK）测定主带的光密度值以计算JnK、ErK、P38、NF-кBP65蛋白表达水平。

2.3 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析。数据以均数±标准差（x± s ）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。

3 结果

3.1 胃组织的病理学变化 光镜观察显示,空白对照组小鼠胃黏膜上皮完整，连续性好，腺体排列整齐，黏膜层组织结构层次清楚。乙醇所致胃黏膜损伤未累及黏膜肌层，可见部分黏膜上皮细胞受损脱落，灶状糜烂出血，固有膜毛细血管扩张充血，腺体肿胀，结构破坏，凝固性坏死，药物组加乙醇组上述变化明显减轻（图1）。

图1 药物对乙醇诱导小鼠酒精性胃溃炎胃组织病变的影响（HE，×100）

3.2 血清中 MPO含量 与空白组相比，乙醇组血清中MPO含量升高（P＜0.01）；药物组血清中MPO含量显著下降（P＜0.001），结果见表 1。

表1 药物对 MPO 的影响（x± s ，n = 10）

3.3 血清中SOD、MDA含量 与空白组相比， 乙醇组血清中MDA含量升高（P＜0.01）；与乙醇组比较，SOD含量降低（P＜0.01）。药物组血清中MDA含量显著下降，SOD含量显著升高（P＜0.01），结果见表 2。

3.4 血清中IL-6、TNF-α含量 与空白组相比，乙醇组血清中IL-6、TNF-α含量显著升高（P＜0.05）。与乙醇组比较，药物组血清液中IL-6、TNF-α含量降低（P＜0.01），结果见表 3。

3.5 胃组织中 JnK、ErK、p38、NF-кBp65蛋白水平 与空白组相比，乙醇组胃组织中JnK、ErK、p38、NF-кBp65蛋白水平显著升高（P＜0.05）；药物组胃组织中JnK、ErK、p38、NF-kBp65蛋白水平降低（P＜0.05），结果见图 2及表4。

表2 药物对 SOD 和MDA 的影响（x± s ，n = 10）

表3 药物对IL-6和TNF-α的影响（x± s ，n = 10）

表4 药物对JnK、ErK、P38、NF-кBP65的影响（x± s ，n = 3）

图2 胃组织中JnK、ErK、P38、NF-кBp65蛋白水平

4 讨论

乙醇引起的胃溃疡与氧自由基具有密切的关系，过量饮酒使乙醇在体内不能及时氧化代谢，就会通过酶或非酶系统产生氧化自由基，引起脂质过氧化反应，并形成脂质过氧化反应产物—MDA，MDA与蛋白质、核酸等生物大分子结合形成脂褐质沉积于细胞中，造成细胞损伤[4]。同时，MPO的主要功能是在吞噬细胞内杀灭微生物，利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐，并形成具有氧化能力的自由基。并在一定条件下催化反应生成过量的氧化剂，超过局部抗氧化剂的防御反应时，就会导致氧化应激和氧化性组织损伤。SOD是催化清除自由基的重要酶类，是胃黏膜的重要保护因子之一[5-6]。长柄侧耳发酵物能显著提高胃溃疡小鼠血清中SOD水平，降低血清中MPO、MDA水平，提示长柄侧耳发酵物可通过清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，减少自由基的生成，起到保护胃黏膜作用。IL-6、TNF-α作为重要的促炎细胞因子，其大量合成与释放会造成炎症反应[7-8]。核因子кB（NF-кB）在感染、免疫反应中起广泛的作用。在炎症反应中，NF-кB与其抑制蛋白聚合的三聚体分离，进而进入细胞核内，与DNA上特异部位结合，调控基因转录活化，诱导细胞合成各种生物大分子如IL-6、TNF-α等[9]。NF-кBp65是NF-кB的亚单位，长柄侧耳发酵物能够抑制NF-кBp65的表达，从而减少NF-кB的核移位来抑制其活性，达到抑制炎性因子IL-6、TNF-α的释放而减轻炎性因子对胃黏膜的损伤。

促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK）链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。MAPK通路包括3个主要成员： p38MAPK,ErK和JnK。这3条通路均可被细胞因子、生长因子和应激因素激活，与炎症有关的主要是p38、JnK和ErK蛋白[9]。长柄侧耳发酵物能够抑制3种炎性蛋白的表达从而起到保护胃黏膜的作用。

本文采用乙醇建立酒精性胃溃疡模型来评价药物的抗酒精性胃溃疡保护作用机制，发现长柄侧耳发酵物可有效减轻小鼠乙醇所致胃溃疡病理学变化，能显著提高胃溃疡小鼠血清中SOD水平，降低血清中MPO、MDA及炎症因子IL-6、TNF-α水平；降低JnK、ErK、p38、NF-кBp65蛋白表达水平。提示长柄侧耳发酵物可能是通过减少体内自由基的生成、有效清除体内过剩的自由基、抑制脂质过氧化反应；抑制NF-кBp65 的表达，减少 NF-кB 的核移位抑制 NF-кB活性，抑制炎性因子IL-6、TNF-α的释放；抑制炎性蛋白的表达来达到对酒精性胃溃疡的预防和保护作用。

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