前列腺癌患者癌组织中miR-21表达水平及与预后的关系分析

杨秋香，邓 实，郭良芳，杨清荣

近年，前列腺癌发病率已高居我国男性泌尿系统疾病首位，内分泌治疗和根治性手术是该恶性肿瘤主要治疗方式，但两种方式皆可因治疗后癌灶转移复发导致治疗失败，故探索前列腺癌发病机制，寻找指示前列腺癌预后的标志物十分必要[1-3]。此前，国际上将前列腺特异抗原(prostate-specific antigen，PSA)>4 ng/mL作为前列腺癌筛查指标，但临床应用中发现，当PSA值处于4～10 ng/mL时，难以区分前列腺良恶性病变，PSA诊断的特异性、敏感性并不够理想[4-5]。随着分子生物学技术的发展，微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,microRNA)为肿瘤标志物的发现提供新思路，microRNA为18～26个碱基大小的非编码单链RNA，可对靶基因发挥调控作用，参与人类癌症发生发展过程[6]。microRNA-21(miR-21)属于microRNA家族成员之一，目前发现，其在肺癌、甲状腺乳头状癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌等多种癌组织中表达异常现象[7]。作者通过特异性TaqMan探针实时定量PCR法探讨miR-21在前列腺癌患者癌组织及癌旁组织中的表达情况，并分析其与患者临床预后的关系，为前列腺癌诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料 选取2011年1月—2012年6月四川大学华西医院76例行前列腺癌手术切除患者资料。纳入标准：①临床诊断符合世界卫生组织有关前列腺癌诊断标准[8]，均行前列腺癌根治性手术治疗，每例术中均获得2份前列腺组织，术后病理检测确定为1份属于前列腺癌灶组织，1份属于癌旁正常前列腺组织；②术前均未接受放化疗、内分泌治疗等保守方式治疗者；③相关病理资料及随访资料完整者。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②复发性前列腺癌者；③术后接受放化疗等方式治疗者；④合并急性感染、高血压、糖尿病、肺结核、风湿病等其他疾病者。76例患者均为男性，年龄47～75(58.89±6.74)岁。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 从-80 ℃冰箱取出经病理切片证实为前列腺癌癌组织和癌旁正常前列腺组织的标本2～3 mm3，冷冻匀浆后加入1 mL TRIzol试剂(购自美国Invitrogen公司)，遵照说明书提取总RNA，再使用20 μL焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)水(购自美国Ameresco公司)溶解提取总RNA；总RNA提取完毕后，采用NanoVue分光光度计(购自美国GE公司)检验获得RNA样品纯度和质量，吸光度处于1.8～2.0之间为达标样品，进行后续反转录。

1.2.2 反转录获得cDNA 取一个200 μL去RNA酶微量离心管(Eppendorf，EP)(购自美国Invitrogen公司)，依次加入5 μL RNA(总RNA量最多5 μg)、2 μL microRNA特异性引物(5×)、1 μL 10 mM dNTP Mix、2 μL DEPC水，总量10 μL，标记为Mix1；另取一个50 μL去RNA酶EP管，依次加入2 μL 10×RT反转录缓冲液、4 μL 25 mM镁离子、2 μL 0.1M dTT、1 μL RNaseout 40 u/μL、1 μL SuperScrip RT(200 U/μL)和Mix1，共20 μL反应液，置入聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(德国Eppendorf公司)，调试程序为16 ℃处理30 min、50 ℃处理30 min、85 ℃处理5 min，反应后获得cDNA模板，试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2.3 实时定量PCR扩增检测 miR-21表达量采用特异性TaqMan探针RT-PCR进行检测，miR-21引物和探针由美国Invitrogen公司设计(引物序列为其专利，不提供具体碱基序列)，U6作为内参基因，miR碱基序列为：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′。准备8 μL超纯水、1 μL特异性引物(20×)、10 μL PCR Master Mix、1 μL cDNA模板，总体系20 μL，置于RT-PCT仪。设置如下反应步骤：①95 ℃，120 s；②95 ℃保持10 s退火，60 ℃保持30 s延伸。进行40个循环，重复实验3次。仪器软件获得CT值，经2-△△CT[9]计算miR-21在前列腺癌组织及癌旁组织中的表达量。

1.3 观察指标 ①分析miR-21在前列腺癌组织及癌旁组织中的表达情况；②以前列腺癌患者癌灶组织与癌旁正常组织miR-21表达量比值为2作为临界值[10]，将患者分为miR-21高表达组和低表达组，分析表达量与临床病理的关系；③采用Kaplan-Meier生存曲线分析miR-21表达量与患者生存的关系。

2 结果

2.1 miR-21在前列腺癌组织及癌旁组织中的表达分析 实时定量PCR分析76份前列腺癌组织和76份癌旁正常前列腺组织miR-21相对表达量发现，miR-21在前列腺癌组织中相对表达量为(2.68±0.54)，明显高于癌旁组织的(1.14±0.42)(t=19.62，P<0.05)，图1，说明miR-21在前列腺癌患者癌组织中具有高表达现象，提示miR-21对前列腺癌具有诊断价值。

图1 miR-21在前列腺癌组织及癌旁组织中的表达分析

2.2 miR-21与前列腺癌患者病理特征的关系分析前列腺癌患者miR-21高表达者57例(75%)，低表达者19例(25%)。2组TNM分期(χ2=9.444，P=0.002)、Gleason评分(χ2=5.197，P=0.023)、18个月内复发转移比较(χ2=10.321，P=0.001)，差异有统计学意义(P<0.05)，而年龄(χ2=0.439，P=0.508)、前列腺体积(χ2=0.179，P=0.672)、血清PSA水平比较(χ2=0.441，P=0.506)，差异无统计学意义(P>0.05)，表1。

表1 miR-21与前列腺癌患者病理特征的关系分析

2.3 前列腺癌患者miR-21表达量与预后 miR-21表达量低组平均生存期32.5个月，miR-21表达量高组平均生存期24.8个月，经Kaplan-Meier生存分析显示，2组差异有统计学意义(P=0.019)，图2。

图2 前列腺癌患者组织miR-21表达量与生存的关系分析

3 讨论

随着分子生物学技术的发展，人们发现microRNA在癌症发病过程中发挥关键作用，不断扮演着抑癌基因或原癌基因角色，且不同癌症microRNA表达谱并不相同[11-12]。miR-21属于microRNA大家族中的一种，长约18～24 bp，被发现时间较早，能够特异性识别并结合mRNA 3′非翻译区，发挥抑制或降解靶mRNA，发挥转录后调控作用，多表达于人体细胞和组织中，参与细胞增殖、分化、凋亡、调控癌症等过程。目前研究显示，其在多种癌症组织中具有过量表达趋势，如肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌等，但有关前列腺癌相关的研究相对较少[13]。本研究检测miR-21在前列腺癌患者癌组织中表达情况，并分析其与患者预后的关系，发现miR-21在前列腺癌患者癌组织中具有高表达现象，且表达情况与前列腺癌患者TNM分期、Gleason评分、复发转移和生存期均有关。

研究发现，大约50%的microRNA定位于癌症基因组位置，通过调控多种靶基因发挥抑癌或原癌基因作用，而miR-21主要定位于染色体17q23.2位置，位于常见FRA17B断裂位点内，此位点被发现是肺癌、结肠癌、乳腺癌过量扩增位点，且与人类TMEM49基因发生部分重叠编码，故miR-21在此位点上调表达，可导致癌症发生[14]。本研究miR-21在前列腺癌组织中高表达，证明其在前列腺癌中表达情况与多种癌症类型过表达一致，miR-21与前列腺癌的发生发展关系密切。张聪等[15]分析miR-21在前列腺癌组织和良性前列腺增生组织中表达情况，发现miR-21在前列腺癌组织中表达水平高于良性前列腺增生组织，认为miR-21参与前列腺癌的发生发展，与本研究论点一致。此外，miR-21还参与雄激素非依赖性前列腺癌进展，主要与miR-21能够在转录过程直接调控前列腺癌雄激素受体表达，促进雄激素分泌，进而促进前列腺癌细胞不断增殖有关[16]。

miR-21不仅可在前列腺癌组织中高表达，而且与前列腺癌手术治疗患者预后疗效密切相关。miR-21高表达组的TNM分期多为Ⅲ～Ⅳ期，Gleason评分≥7分，18个月内复发转移率高，生存期短，且与低表达组差异显著，说明miR-21表达与前列腺癌进展程度、组织学分级、癌灶复发转移和生存期密切相关。肿瘤TNM分期越高，Gleason评分越高，预示肿瘤恶性程度越高，即便给予根治性手术切除，仍有较高复发转移风险，降低生存期；而miR-21表达则可指示患者预后，能够为后期辅助治疗方案的制定提供参考，提高治疗成功率。目前有关miR-21表达与前列腺癌治疗预后的报道并不多，仅张聪等[15]证实，miR-21与前列腺癌手术治疗患者术前Gleason评分相关。抑制肿瘤细胞miR-21表达，其细胞核内AR、AKT、mTOR等蛋白均呈下调表达趋势，可抑制前列腺癌细胞增殖，故miR-21有望成为前列腺癌新的基因治疗靶点。

总之，miR-21在前列腺癌组织中高表达，可能参与该癌症的发生发展过程，miR-21表达与前列腺癌手术治疗患者的TNM分期、Gleason评分、复发转移和生存期密切相关，说明其可指示预后疗效。但临床应用组织学标本检验miR-21表达情况，受限于样本取样，并不适于广泛推广，后期还需探究血清miR-21水平在前列腺癌患者中的表达及与预后的关系，及分析miR-21如何影响前列腺癌的生物调节机制，方可利于抗癌技术发展，任重而道远。

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