离体猪肝胆道内射频消融时毗邻胆道热休克蛋白70表达情况

杨 超，卢 伟，马军朋，杨 剑，蒋富强，杜 鹏，张嘉诚，解 鹏，张 哲

恶性胆道梗阻是由胆管癌、胰头癌、肝癌等恶性肿瘤引起的胆汁引流不畅所致的恶性黄疸。使用双极射频消融导管(HabibTMEndoHPB)行胆管内消融疏通已堵塞的胆道并植入金属支架，取得了较长时间的高开通率，同时对胆道支架植入术后再次堵塞的患者还可再行消融治疗[1-5]。作者前期研究证实胆道内热消融时因为胆汁的局部温度升高，其热量可能通过胆汁传递至毗邻非消融胆管内，但在常规消融参数下毗邻非消融区胆管未见明显损伤[6]。热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一组生物体内普遍存在、进化上高度保守的蛋白质家族，又被称为分子伴侣。大量资料表明，在应激状态下HSP70参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程，是一种保护性蛋白，受到高温等恶劣环境袭击时，组织就会大量合成[7]。本研究利用免疫组织化学方法检测胆管内射频消融后毗邻胆管HSP70的表达水平，并探讨不同消融功率下毗邻消融靶区的胆管组织内HSP70表达的差异及意义。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物器官：15例健康本地长白猪新鲜离体猪肝，均保留有完整的胆囊及中上段胆总管；②器械：包括经皮穿刺式双极射频导管HabibTMEndoHPB(英国EMcisio公司)、超滑导丝(0.035 inch，日本Terumo公司)、单弯导管(5Fr，上海Cordis公司)；③仪器：数字减影血管造影机(digital subtraction angiography，DSA)(AlluraXper FD20,荷兰Philips公司)，射频发生仪(Model 1500X,美国Rita Medical Systems公司)，SP试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；④实验药品：对比剂(碘佛醇370)，人胆汁(提前自胆道梗阻患者胆道引流管内收集)。

1.2 方法

1.2.1 建立人胆汁充盈离体猪肝胆道系统消融模型 将新鲜离体猪肝放置于DSA手术台上，仔细查看确保胆道系统完好无损。使用注射器经胆总管缓慢注入提前收集好的人胆汁，在DSA透视下经胆总管引入超滑导丝，然后置入5Fr单弯导管，退出导丝后注入碘佛醇造影，证实胆道系统完整无损伤。经单弯导管引入导丝后撤出导管，于DSA透视下经导丝插入HabibTMEndoHPB射频消融导管至胆总管上端近肝门区并用缝线将消融导管与胆总管绑紧，防止胆汁渗漏(图1)，并连接好射频发生仪。

A：射频消融导管插入新鲜离体猪肝肝门区胆管内；B：经消融导管造影证实胆道系统完好

1.2.2 离体猪肝胆管内消融及免疫组化染色 15个新鲜离体猪肝随机分为3组、每组5个，所有猪肝均消融120 s，第1、2、3组分别采用10 W、12 W、14 W功率消融，消融后取距远端消融电极1 cm、2 cm处胆管组织。鼠抗HSP70单克隆抗体(1∶50)，操作严格按照试剂盒说明进行。3，3-二氨基苯联胺(diaminobenzidine，DAB)显色，采用S-P法对全部标本进行免疫组化染色，染色前使用微波炉进行抗原修复。用已知阳性组织切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判定 观察到黄色或棕黄色颗粒时判定为阳性结果，随机观察100个细胞，HSP70的染色结果(表达强度)分为3级。1级，阳性细胞数<30%，染色颗粒浅黄、细小、成堆；2级，阳性细胞数为30%～60%，染色颗粒深黄、粗大、成片；3级，阳性细胞数>60%，染色颗粒棕黄、粗大、成片[7]。

1.3 统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件，分别采用Spearman相关分析及Wilcoxon秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 消融模型建立 本研究中，人胆汁充盈离体猪肝胆道系统消融模型均成功建立(图1A、B)。15例猪肝共30例胆管组织HSP70表达强度记录见表1。

2.2 胆管组织HSP70表达强度 消融区域胆管壁大体肉眼观呈灰黄色至深黄色改变，管壁周围可见胆汁渗入胆管壁，毗邻胆管壁未见明显变化(图2)。距远端消融电极1 cm处胆管组织HSP70表达强度：1级染色4例(26.7%)，2级染色6例(40%)，3级染色5例(33.3%)；距远端消融电极2 cm处胆管组织HSP70表达：1级染色10例(66.7%)，2级染色4例(26.7%)，3级染色1例(6.6%)。不同消融功率与HSP70表达强度结果见表1。

表1 消融功率与HSP70表达强度

消融功率越高，消融区毗邻胆管(距远端消融电极1 cm)HSP70表达强度越强，两者呈明显正相关(r=0.755，P<0.001)；距远端消融电极1 cm处胆管组织HSP70表达强于距远端消融电极2 cm处的表达(Z=-2.334,P<0.05，表2)，越靠近消融区域的胆管越可能受到消融热量的影响损伤，从而HSP70大量快速表达以修复热损伤(图3)。

使用14 W功率消融120 s后消融区胆管壁深黄色，胆汁渗入肝组织；距消融区1、2 cm处胆管壁颜色未见明显变化

表2 取材位置与HSP70表达强度

注：Z=-2.334,P<0.05

使用14 W功率消融120 s后取距消融区1 cm处胆管组织行免疫组化检测，可见多数胆管上皮细胞核及胞浆中出现深黄色颗粒，HSP70表达强度判定为2级(HE染色，×400)

3 讨论

近年来胆管内射频消融治疗恶性胆道梗阻已逐渐应用于临床，并取得了较满意的疗效[5，8-9]。作者前期研究证实胆管内射频消融所产生的热量会经胆管内胆汁传递至毗邻消融区的正常胆管，病理切片证实不会损伤正常胆管及毗邻肝组织。大量资料表明，组织在应激状态下HSP参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程，是一种保护性蛋白，受到高温等恶劣环境袭击时，组织就会大量合成[10-12]。本研究发现胆管内射频消融后，毗邻消融区的胆管组织出现HSP70的表达，且表达强度与消融功率呈正相关。说明胆管内射频消融时，产生的热量会使毗邻正常胆管组织出现应激状态，合成HSP70以抗热损伤并进行修复。随着功率的增加，热量经胆汁传递至邻近组织增多，诱导产生的HSP70不足以抵抗热损伤时，毗邻消融区的正常胆管则可能首先出现可逆性的热损伤，如组织出血、水肿等炎性反应。当消融功率及消融时间继续增加时，毗邻消融区的正常胆道则可能出现不可逆的热损伤，从而造成毗邻正常胆道狭窄、挛缩或胆瘘等并发症。

据文献报道,HSP70在肿瘤免疫中亦发挥重要作用,HSP70不仅参与肿瘤抗原的加工呈递,而且可作为抗原呈递分子直接将肿瘤抗原肽呈递给T细胞,激发T细胞介导的特异肿瘤细胞免疫[13-15]。因此，当进行胆道内射频消融治疗恶性胆道梗阻，且未出现毗邻胆管组织不可逆性热损伤时，其所产生的HSP70不仅可以抵抗射频消融所产生热量经胆汁传递造成的热损伤，并且可能对肿瘤免疫发挥一定作用。

总之，本研究结果表明，胆管内射频消融可导致消融区毗邻胆管组织HSP70表达，远离消融区域胆管(距离远端消融电极≥2 cm)HSP70表达无明显增多；随着消融功率的增加，毗邻消融区胆管组织内HSP70表达强度亦随之增加。因此，在目前临床常规应用消融参数下，经皮肝穿胆管内射频消融对消融区毗邻正常胆管组织是安全可靠的，但随着消融功率的增加则可能对毗邻正常胆管产生热损伤。本研究使用新鲜离体猪肝，胆囊及中上段胆总管内的胆汁是不流动的，后续可在此研究基础上建立活体动物实验模型，从而更为准确模拟临床实际、评估胆道内射频消融后毗邻正常胆管损伤情况。

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