按法对兔急性闭合性软组织损伤影响的实验研究*

2018-06-19郭银丰罗华送任兴昌雷言坤韩金生

浙江中医杂志 2018年6期

郭银丰王睿罗华送任兴昌闫涛雷言坤韩金生

浙江省杭州市中医院浙江杭州 310007

对急性闭合性软组织损伤实施推拿治疗时少有即时实施手法者，而且大都运用多个手法组合或成套手法，形成手法多样、组合多样的局面，每个手法的具体作用不明确，也无法确切说明哪些手法、如何组合和如何把握手法的度才能更有效地治疗软组织损伤。而且推拿治疗急性软组织损伤的实验研究却极少。基于上述现实，笔者认为需研究单一手法的效用、优势后方可明确组合依据，形成更严密、规范的组合，以提高治疗效果。实验介绍如下。

1 材料

1.1 实验动物：清洁级中国长耳兔100只，体重在2～2.5kg，实验动物中心常规饲养。

1.2 实验主要试剂及仪器：兔前列素E2（PGE2）ELISA试剂盒、兔五羟色胺（5-HT）ELISA试剂盒和兔β（β-EP）内啡肽ELISA试剂盒（上海百沃科贸有限公司）；5804R型高速离心机（艾本德中国有限公司）；680型酶标仪（美国伯乐公司）；电子天平MP120-1（上海第二天平仪器厂）。

2 方法

2.1 造模方法：参照周国林等[1]的方法略加改进制备兔软组织损伤模型。动物由浙江中医药大学动物实验中心提供，造模前先将中国长耳兔适应性饲养1周，实验前24h用剪刀剪去兔右侧大腿根部（肌肉丰厚处）外侧毛，再涂以6%硫化钠脱毛剂脱毛。将兔子麻醉后，左侧在下，并将其固定，将一长30.0cm、直径3.0cm、内壁光滑的管道下口对准剪毛的部位，使其垂直，将一质量250g、直径2.5cm的打击铁锤置于管道上口，稳定后让铁锤自由落下，打在兔子右侧大腿根部外侧肌肉丰厚处，避开腿骨。连续打击2次，可见受打击部位皮肤有细小出血点。每只动物仅打击右腿。数分钟后手摸有明显肿胀触感及皮温升高感者说明造模成功，有合并局部皮肤破损或骨折者予以剔除。

2.2 动物分组：将造模成功的100只中国长耳兔随机平均分为模型组、A组、B组、C组和D组5组，每组20只。再根据处死时间（即初次按压10min后、第2天按压10min后、第4天按压10min后及第7天按压10min后）分为1、2、3、4四个亚组；命名为模型组1，A1组、B1组、C1组、D1组5组，以此类推，每组5只。

2.3 实验方法：造模成功后，立即对所有治疗组实施不同强度当量按压。治疗各组处死之前每天进行1次按压治疗。模型组：不使用任何治疗措施。A组：找准打击部位施以250g强度当量按压10min；B组：找准打击部位施以500g强度当量按压10min；C组：找准打击部位施以1000g强度当量按压10min；D组：找准打击部位施以2000g强度当量按压10min。造模完成后进行10min的第1次按压治疗，按压完毕后抽取耳缘静脉血4m1左右，然后将所有第1亚组实验动物处死，并检测相应指标。第2天在对治疗各组的2、3、4亚组于相应时相进行上诉按压后抽取耳缘静脉血4m1左右，然后处死所有第2亚组实验动物，并检测相应指标。第4天在对治疗各组的第3、第4亚组于相应时相进行上诉按压后抽取耳缘静脉血4m1左右，然后处死所有第3亚组实验动物，检测相应指标。第7天在对治疗各组的第4亚组于相应时相进行上诉按压后抽取耳缘静脉血4m1左右，然后处死所有第4亚组动物检测相应指标。

2.4 样本采集：分述如下。

2.4.1 β-EP的检测：血样品的采集：造模成功后所有100只动物取耳缘静脉血4m1左右，作为治疗前各组血样。在动物干预后处死前再次取耳缘静脉血4m1左右，作为干预后各组血样。血样品处理流程：将所取的血样静置4小时。待凝固后以3500r/min转速离心15分钟。提取血清量≥600μ1，置于-20℃冷冻保存，集中进行外周血清中β-EP指标检测。具体操作步骤按照试剂盒要求完成。

2.4.2 前列腺素E2的检测：①剪取处死兔受打击部位的中心且呈青紫色的肌肉组织；②用生理盐水漂洗1分钟，然后滤纸吸干备用，使用天平称取100mg肌肉组织；③向每10mg肌肉组织加入生理盐水0.5ml，置于匀浆器中缓慢而均匀地研研磨15min，使得匀浆液呈均匀一致悬浊液；④倒入试管中，在2500r/min转速下离心15分钟；⑤收集上部清液，置于-20℃冰箱中备用。用放免法测定前列腺素E2水平。具体操作步骤按照试剂盒要求完成。

2.4.3 5-HT检测：方法同β-EP检测方法。

3 结果

3.1 不同强度按法对急性闭合性软组织损伤兔5-HT表达水平的影响：见表1。

3.2 不同强度按法对急性闭合性软组织损伤兔PGE2表达水平的影响：见表2。

3.3 不同强度按法对急性闭合性软组织损伤兔β-EP表达水平的影响：见表3。

表1 不同强度按法对急性闭合性软组织损伤兔5-HT表达水平的影响（±s，ng/ml）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

145.07±46.02 80.74±44.99 61.86±18.44 97.75±13.59 84.45±34.92模型组A组B组C组D组167.02±70.00 89.77±27.26*113.94±28.99 102.38±24.57*96.28±26.31*126.25±35.62 127.07±58.39 86.66±20.16 114.47±19.22 115.09±45.61 150.36±59.06 111.77±15.32 115.22±50.32 122.72±62.89 107.44±21.33

表2 不同强度按法对急性闭合性软组织损伤兔PGE2表达水平的影响（±s，pg/ml）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

模型组A组B组C组D组66.78±37.97 38.27±29.77 43.32±7.15 57.48±21.37 67.01±13.79 84.91±40.04 27.14±13.49*40.29±6.13*54.14±12.02 54.79±7.98*109.63±44.96 24.62±5.62*40.81±11.76*63.68±35.33*76.02±43.05 119.01±28.88 18.98±14.31*30.12±7.22*44.96±14.27*43.93±7.70*

表3 不同强度按法对急性闭合性软组织损伤兔β-EP表达水平的影响（±s，ng/ml）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

模型组A组B组C组D组13.27±2.12 9.38±1.43*7.04±2.26*5.27±1.38*3.97±0.70*9.01±3.67 7.57±2.88 6.22±1.53 6.22±2.63 8.07±2.56 10.19±4.39 9.04±2.12 4.56±1.42 8.03±1.69 7.06±1.75 8.12±2.97 7.56±1.61 7.60±3.19 5.07±9.77 6.26±1.14

4 讨论

软组织损伤属中医学中“伤筋”之范畴。《普济方·折伤门》云：“若因伤折内动经络，血行之道不得宣通。瘀积不散，为肿为痛。”由此可见，损伤的病机主要是气滞血瘀，疼痛和肿胀是急性损伤主要的临床表现。因此，必须“疏其血气，令其条达，而致和平”，而“按之则气血散，故按之痛止”。

现代医学认为急性软组织损伤的病理变化表现为局部组织细胞坏死、毛细血管扩张、炎症细胞浸润、水肿、出血等。由于致痛物质组织胺、5-羟色胺、缓激肽、K+、H+等，及创伤性水肿刺激了痛觉感受器，并传入神经中枢而引起疼痛，此时间致痛物质浓度升高等导致骨骼肌和血管痉挛，形成疼痛—缺血—疼痛之恶性循环。本实验研究表明按法作用于损伤局部，可能通过降低5-羟色胺浓度对痛觉感受器的刺激，同时减轻了骨骼肌及血管痉挛，降低前列腺素E2含量抑制局部炎症，从而缓解疼痛。按法在损伤初期降低β-EP释放，可能是减少白细胞和免疫细胞在损伤部位的聚集造成的。也就是说按法可能对减轻损伤机体应激反应起到了作用。

本研究表明按法可以用于急性闭合性软组织损伤的立刻治疗，无需等24小时后。按法的取效机理可能是通过影响PGE2、β-EP、5-HT的体内含量而对急性闭合性软组织损伤起到治疗作用。有部分数据不尽人意，原因不确定，可能与具体操作、造模时损伤轻、样本数少等因素有关。