HPLC法测定舒肝解郁胶囊中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的含量

胡洁，苟琰，周娟

舒肝解郁胶囊为成都康弘药业集团有限公司独家品种，其原标准号为YBZ10382008，具有疏肝解郁，健脾安神等功效，用于治疗轻、中度单相抑郁症属肝郁脾虚证者，症见情绪低落、兴趣下降、迟滞、入睡困难、早醒、多梦、紧张不安、急躁易怒、食少纳呆、胸闷、疲乏无力、多汗、疼痛、舌苔白或腻，脉弦或细。处方由贯叶金丝桃和刺五加两味药组成。原标准仅有总黄酮的紫外吸收度检查，专属性差，可控性不强。贯叶金丝桃含量测定采用的方法多为HPLC，且多为二元梯度，参考了相关文献资料[1-2]，进行了二元梯度的分离，分离度和峰形不能达到要求，后改为三元梯度，在进行梯度优化后，分离度和峰形均能达到要求。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪（四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器以及Agilent数据处理）；甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher公司）；水为Milli-Q超纯水；其余试剂均为分析纯；对照品。

芦丁对照品（中检所：100080-200707，含量9 0.5%），金丝桃苷对照品（中检所：111521-201004，含量93.9%），异槲皮苷对照品，（中检所：111809-201202），中国药品生物制品检定所；疏肝解郁胶囊，每粒装0.36g，生产批号：101002,成都康弘药业集团有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：AQ Welch（C184.6×250 mm 5 μm）；流动相：A为甲醇，B为乙腈，C为0.1%磷酸溶液，按表1进行梯度洗脱，流速0.6 mL·min-1，柱温35 ℃，检测波长为360 nm。色谱图见图1。

表1 流动相梯度

图1 HPLC图A.缺贯叶金丝桃阴性 B.舒肝解郁胶囊样品 C.对照品1.芦丁 2.金丝桃苷 3.异槲皮苷

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取芦丁对照品20.12 mg；金丝桃苷对照品10.12 mg；异槲皮苷对照品16.40 mg分别置50 ml、25 ml、25 ml的容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取芦丁对照品溶液5 ml、金丝桃苷对照品2 ml、异槲皮苷对照品1 ml置同一25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取疏肝解郁胶囊内容物0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 ml，称定重量，超声处理（250 W，40 kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.3 阴性试验

取缺贯叶金丝桃的试样，按“2.2.2”项下方法制备，得阴性溶液。结果在芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷各峰对应的保留时间处无干扰杂质峰。

2.4 线性关系考察

精密称取芦丁标准品、金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品适量，加甲醇分别制成芦丁0.4、0.04、0.02、0.005、0.0025 mg·mL-1；金丝桃苷0.4、0.2、0.03、0.008、0.004 mg·mL-1；异槲皮苷0.3、0.15、0.02、0.001、0.0005 mg·mL-1的溶液，分别吸取10 μL，注入液相色谱仪，按色谱条件测定。以对照品进样量（Y）为横坐标，峰面积为纵坐标(X)绘制标准曲线。结果见表2。

表2 线性关系试验结果（N=5）

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察 取“2.2.1”项下的混合对照品溶液10 μl，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的RSD分别为0.72%、0.95%、0.34%。表明仪器性能良好。

2.5.2 重复性试验 取同一样品6份，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，分别进样10 μl测定，记录各成分色谱峰的峰面积，计算含量。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷含量的平均值（n=6）分别为11.45 mg·g-1、5.64 mg·g-1、8.41 mg·g-1；RSD分别为0.42%、0.36%、0.33%，表明本方法重复性好。

2.5.3 稳定性试验 取同一样品的供试品溶液，置室温下放置，分别在0、4、8、16、24、36 h各进样10 μl，测定各成分色谱峰的峰面积，计算芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷RSD分别为0.69%、0.36%、0.42%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.5.4 加样回收率试验 取已知含量的样品（批号：101002，含量：芦丁11.45 mg·g-1；金丝桃苷：5.64 mg·g-1；异槲皮苷：8.41 mg·g-1）6份，每份0.15 g，精密称定，分别加入芦丁对照品、金丝桃苷对照品和异槲皮苷对照品适量，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，并测定含量。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的平均回收率(n=6)依次为102.1%（RSD=0.69%），99.9%（RSD=1.23%），102.6%（RSD=1.98%）.结果见表3。

表3 样品中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷加样回收率试验结果(N=2)

2.5.5 耐用性试验 取样品（批号：101002），精密称定，按拟定的含量测定方法，对同一批号样品，不同分析人员，不同设备,不同色谱柱进行测定。其含量结果见表4。

表4 样品中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷耐用性试验结果(N=2)

2.6 样品测定

分别精密称取11批不同批号样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每批样品采用双针双样进行测定。结果见表4。

表4 样品测定结果（n=2）

3 讨论

按文献资料的条件对样品中的芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷进行测定，发现金丝桃苷和异槲皮苷因为结构相似，分离度较差。于是对流动相进行了优化，采取甲醇、乙腈、0.1%磷酸溶液三相流动相，在梯度洗脱条件下，各组分保留时间在30分钟左右，分离度好。

本实验首次采用高效液相色谱方法同时测定舒肝解郁胶囊中三种成分的含量，并进行了方法学考察，所建立的方法简单易行、干扰小，为舒肝解郁胶囊质量标准的全面提高提供了科学依据。

[1]杨志芳,王维娜, 杨坤,王先荣, 杨新波,黄正明.HPLC法测定不同产地黄蜀葵花中金丝桃苷异槲皮苷及槲皮素-3'-葡萄糖苷含量[J]中国科学院上海冶金研究所; 材料物理与化学(专业) 博士论文 2000年度

[2]王光涵，张振秋，张颖，姜鸿，邹桂欣HPLC法测定刺玫果中芦丁和金丝桃苷的含量[J]辽宁中医药大学学报 2010年06期