少孢节丛孢菌几丁质酶AO-801基因的分子特征分析及其多克隆抗体制备

贡莎莎， 孟庆玲， 乔 军， 钟文强， 陈 英， 才学鹏

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003； 2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046)

现有的研究发现，捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌产生的侵染性胞外蛋白酶在其侵染线虫时能够发挥重要作用[1-5]。然而，以往的研究多集中在探讨捕食线虫性真菌胞外酶丝氨酸蛋白酶的机制和功能上，鲜有对捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌的几丁质酶的相关报道。Yang等已经从少孢节丛孢菌(Arthrobotrysoligospora)全基因组中鉴定出16个开放阅读框(ORF)编码假定的几丁质酶[5]，对其进行功能结构域、分子量和转录分析表明，大多数几丁质酶在碳源缺乏、含有几丁质底物或植物病原真菌时表达量上调，提示少孢节丛孢菌几丁质酶可能发挥重要作用。

少孢节丛孢菌是目前研究最多的一种捕食线虫性真菌，在自然界中广泛分布[2]。2011年，Yang等首次对捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌进行了全基因组测序[4]，对基因组编码的侵染性胞外蛋白酶进行了生物信息学分析，共发现和鉴定出16个几丁质酶，然而这些几丁质酶的生物学功能尚未被深入研究。为了研究少孢节丛孢菌在侵染线虫中高表达的几丁质酶AO-801的生物学功能，本研究对少孢节丛孢菌 XJ-A1 几丁质酶AO-801基因进行克隆，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，拟纯化获得重组AO-801蛋白酶，制备高效价的多克隆抗体，为研究少孢节丛孢菌中该蛋白酶作用的分子机制奠定前期基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂

捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1、EscherichiacoliDH5α菌株、EscherichiacoliBL21(DE3)菌株和表达载体pET32a，由石河子大学动物科技学院实验室保存。2×TaqPCR Master Mix、透析袋，购自广州东盛生物科技有限公司。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、pMD19-T载体、组氨酸标签(His-tag)融合蛋白纯化柱(SinoBio)，购自TaKaRa公司。EZ Spin Column Fungal RNA Isolation Kits试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。鼠抗His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，购自北京全氏金生物技术有限公司。Soluble TMB Substrate Solution，购自天根生化科技(北京)有限公司。T4DNA连接酶，购自Promega公司。。

1.2 几丁质酶AO-801引物的设计

根据GenBank中登录的AO-801基因序列，用Primer 5软件设计合成1对特异引物，上、下游引物分别引入EcoR Ⅰ、XhoⅠ限制性内切酶位点，上游引物：5′- CCGGAATTC ATGAAGGCCATCTATGGACGTAACT-3′(下划线部分为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物：5′-CCGCTCGAGTCA AGCGCAAGCGCTGCG-3′(下划线部分为XhoⅠ酶切位点)。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.3 几丁质酶AO-801基因的扩增与克隆

将少孢节丛孢菌XJ-A1分离株接种于YPSSA培养基上，于20 ℃霉菌培养箱内培养1周。取适量菌丝，用TaKaRa真菌RNA提取试剂盒提取XJ-A1分离株RNA，用RT试剂盒反转录成cDNA，进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增。20 μL PCR反应体系：9 μL H2O2，8 μL PCR Mixture，各0.5 μL上下游引物，2 μL提取的cDNA模板。AO-801基因扩增反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 120 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收。将回收的AO-801基因片段与pMD19-T载体连接后转化至E.coliDH5α感受态细胞，经氨苄青霉素抗性平板筛选及菌液PCR验证后，送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.4 几丁质酶AO-801分子特征分析

将测序结果与少孢节丛孢菌标准株[美国模式培养物集存库(American type culture collection，简称ATCC) 24927]的几丁质酶AO-801进行比对分析，并利用生物在线分析软件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，http：//www.ebi.ac.uk/interpro/，http：//www.expasy.org/tools/，SMART，Prabi，SWISS-MODEL等)进行相关生物信息学分析。

1.5 原核表达质粒pET-AO801的构建

用EcoR Ⅰ和XhoⅠ分别对pMD19-T-AO801和pET32a质粒进行双酶切，回收pET32a载体片段和AO-801目的片段，在T4DNA连接酶作用下，于4 ℃过夜连接后转化入E.coliDH5α感受态细胞中，在氨苄抗性平板上于37 ℃过夜培养，挑取单菌落，再经菌液PCR和双酶切方法筛选阳性克隆(命名为pET-AO801)。

1.6 目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定

将重组质粒pET-AO801转化入E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性克隆于含氨苄抗性的5 mL液体LB培养基中，37 ℃、180 r/min过夜培养，再取3mL菌液接种于 200 mL 液体LB培养基中，培养至D600 nm约为0.6～0.8，加入终浓度为1 mmol/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，简称IPTG)，进行诱导表达。诱导6 h后收集菌体，对重组菌的表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析。

1.7 重组几丁质酶AO-801的纯化及多克隆抗体制备

诱导6 h后于8 000 r/min离心10 min，收集菌体，加 15 mL 裂解液(lysis buffer)裂解菌体，用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。将纯化的重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混匀后按 0.2 mL/只的剂量皮下注射接种给小鼠，14、21 d后再将纯化的蛋白与弗氏不完全佐剂混匀并注射小鼠，采血分离血清。

1.8 重组几丁质酶AO-801多克隆抗体效价的测定

用包被缓冲液将纯化的重组蛋白稀释为10 μg/mL，酶标板各加入100 μL/孔，4 ℃过夜。扣干，加入300 μL/孔洗涤缓冲液洗3次；用150 μL/孔封闭液于37 ℃封闭1 h；洗涤3次后，加入不同稀释度的血清，100 μL/孔，37 ℃孵育2h，洗涤清洗5次，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1 ∶2 000)溶液，37 ℃孵育1 h。洗涤缓冲液清洗5次后，加入100 μL/孔TMB显色液，37 ℃避光反应30 min，加入 100 μL/孔 2 mol/L硫酸终止反应。用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增结果

以少孢节丛孢菌的cDNA为模板，通过RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明，PCR扩增产物大小约为1 100 bp，与GenBank中提供的AO-801基因片段大小一致(图1)。

2.2 测序结果及序列分析

经测序，AO-801基因全长1 448 bp，有3个内含子序列，分别位于第139～204、442～513和1 183～1 361位核苷酸，内含子具有保守的5′-GT、3′-AG末端，符合真菌内含子特征；有1个1 131 bp的开放阅读框(ORF)，编码376个氨基酸，无信号肽序列(图2)；与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)的几丁质酶基因AO-801核苷酸序列的同源性为95.96%，氨基酸序列的同源性为97.34%。Scanprosite软件分析发现，该几丁质酶属于糖苷水解酶18家族，其特征序列为第120～128位氨基酸的LDGVDVDWE；有2个高度保守的区域SIGGW、LDGVDVDWE，SIGGW位于第82～86位氨基酸，为底物结合位点，LDGVDVDWE位于第120～128位氨基酸，为水解酶催化活性位点。

经过SMART在线分析，AO-801编码的蛋白具有1个Glyco-18结构域，位于第3～333位氨基酸；Interpro软件预测结果显示，几丁质酶AO-801存在1个几丁质酶插入域，位于第243～304位氨基酸位置(图3)。SWISS-MODEL软件的三级结构预测结果(图4)显示，几丁质酶AO-801具有(α/β)8的三磷酸异构酶(triosephosphate isomerase，简称TIM)桶形结构域(简称TIM桶)，与烟曲霉YJ-407的几丁质酶结构相似。

2.3 重组质粒pET-AO801的双酶切鉴定

重组质粒pET-AO801经PCR和双酶切鉴定， 得到大小约为1.1 kb的插入片段，与预期一致(图5)。测序结果表明，插入片段大小为1 131 bp，为目的基因片段，表明开放阅读框正确。

2.4 重组蛋白AO-801的诱导表达、纯化及SDS-PAGE和Western-Blot分析

阳性菌落经1 mmol/L IPTG诱导6 h后提取蛋白，表达产物经SDS-PAGE分析(图6)后，在相对分子质量约为59 ku处可见特异性反应条带，分子量与预期值相同。利用镍柱纯化技术纯化重组蛋白酶，经SDS-PAGE分析，得到单一条带，且与预期大小一致。Western Blot分析(图7)表明， 表达的重组蛋白酶能与少孢节丛孢菌阳性血清发生特异性血清学反应。

2.5 间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，简称ELISA)检测多克隆抗体

用间接ELISA测定抗AO-801多克隆抗体效价。将抗血清稀释至不同浓度(1 ∶200～1 ∶25 600)，检测结果显示，多克隆抗体效价达到1 ∶25 600(图8)。

3 讨论

目前国内外已有报道表明，少孢节丛孢菌在侵染线虫过程中分泌的胞外水解酶(蛋白酶、胶原酶和几丁质酶)在侵入线虫表皮和降解线虫细胞的过程中发挥着重要作用[2-4]。几丁质是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的链状高分子化合物，是含量仅次于纤维素的第二大生物高聚物，也是大多数线虫体壁及其虫卵外壳的主要成分[5]。已有研究表明，许多真菌在其整个生长过程中都会产生几丁质酶，源于致病性真菌的几丁质酶能催化几丁质β-1，4糖苷键水解，对真菌侵入线虫表皮屏障并进一步降解宿主细胞有重要的作用[1，3-5]。

1989年Dackman等在捕食线虫性真菌培养液中检测到几丁质酶活性，并发现几丁质酶的活力水平与致病性密切相关[6]。近年来，Taib等在烟曲霉中发现了14个几丁质酶[7]，且烟曲霉YJ-407几丁质酶的晶体结构已有初步研究[8]。此外，Dünkler等在白色念珠菌中发现4个几丁质酶[9]，在丝状真菌构巢曲霉中发现了18个几丁质酶，在绿僵菌中发现了24个几丁质酶[10]，越来越多的有功能的几丁质酶不断在细菌、病毒、真菌、植物以及动物等不同生物上被发现。

本研究中对少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1几丁质酶基因AO-801进行了克隆和分子特征分析，发现AO-801酶属于糖苷水解酶18家族，也具有类似的结构域，含有几丁质底物结合位点、水解酶催化活性位点[11-14]，同时还发现1个几丁质酶插入域(chitinase insertion domain，简称CID)。许多GH18中的几丁质酶含有CID，通常CID由5个或5个反平行β-折叠和1个α-螺旋组成，并且其插入TIM桶的第7个α-螺旋和第7个β-折叠之间[15]。CID与TIM桶能够使几丁质酶和底物牢固结合，从而更有利于底物的降解。Li等将来自古细菌、细菌、真菌、植物和动物的共27个含有几丁质酶插入域的几丁质酶序列进行比对和分析，确定了1组高度保守的疏水残基对几丁质酶的折叠和结构稳定性很重要，并推测TIM桶结构域+CID可以通过提供深的底物结合裂缝来结合长链底物，但是关于CID在几丁质酶发挥功能中的作用尚未完全确定[16]。少孢节丛孢菌几丁质酶AO-801存在的TIM桶结构域和CID可能预示其能更好地与底物结合，可能在真菌捕食线虫的过程中发挥重要作用。此外，Arakane等发现，高度糖基化的接头可以保护几丁质酶免于发生蛋白水解，而在AO-801中并未发现存在糖基化位点[17]。

真菌在其整个生长过程中能产生多种几丁质酶，不同真菌几丁质酶的生物学功能及其在致病过程发挥的作用也存在差异[18-19]。Arnold等报道的GH18可能参与线虫的蜕皮以及幼虫孵化等过程[20-21]。Khan等将拟青霉菌的几丁质酶作用于爪哇根结线虫虫卵，发现几丁质酶显着改变了卵壳结构，并且卵黄层被分裂并失去其完整性[22]。少孢节丛孢菌是新疆地区分布广泛的捕食线虫性真菌，通过对捕食线虫性真菌胞外水解酶——几丁质酶功能的深入研究将有助于开发适合新疆地区的线虫防控真菌制剂。

参考文献：

[1]Tzelepis G，Dubey M，Jensen D F，et al. Identifying glycoside hydrolase family 18 genes in the mycoparasitic fungal speciesClonostachysroseae[J]. Microbiology，2015，161(7)：1407-1419.

[2]Zhao H，Qiao J，Meng Q，et al. Expression of serine proteinase P186 ofArthrobotrysoligosporaand analysis of its nematode-degrading activity[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2015，108(6)：1485-1494.

[3]赵海龙，孟庆玲，乔 军，等. 少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶基因的克隆及生物信息学分析[J]. 西北农业学报，2015，24(3)：26-32.

[4]Yang J K，Wang L，Ji X L，et al. Genomic and proteomic analyses of the fungusArthrobotrysoligosporaprovide insights into nematode-trap formation[J]. PLoS Pathogens，2011，7(9)：e1002179.

[5]Yang J，Yu Y，Li J，et al. Characterization and functional analyses of the chitinase-encoding genes in the nematode-trapping fungusArthrobotrysoligospora[J]. Archives of Microbiology，2013，195(7)：453-462.

[6]Dackman C，Chet I，Nordbring‐Hertz B. Fungal parasitism of the cyst nematodeHeteroderaschachtii：infection and enzymatic activity[J]. FEMS Microbiology Letters，1989，62(3)：201-208.

[7]Taib M，Pinney J W，Westhead D R，et al. Differential expression and extent of fungal/plant and fungal/bacterial chitinases ofAspergillusfumigatus[J]. Archives of Microbiology，2005，184(1)：78-81.

[8]Hu H Y，Wang G G，Yang H T，et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of a native chitinase from the fungal pathogenAspergillusfumigatusYJ-407[J]. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography，2004，60(5)：939-940.

[9]Dünkler A，Walther A，Specht C A，et al.CandidaalbicansCHT3 encodes the functional homolog of the Cts1 chitinase of Saccharomyces cerevisiae[J]. Fungal Genetics and Biology，2005，42(11)：935-947.

[11]Funkhouser J D，Aronson N N. Chitinase family GH18：evolutionary insights from the genomic history of a diverse protein family[J]. BMC Evolutionary Biology，2007，7(1)：96.

[12]Huang Q S，Xie X L，Liang G，et al. The GH18 family of chitinases：their domain architectures，functions and evolutions[J]. Glycobiology，2012，22(1)：23-34.

[13]Tellam R L. Protein motifs in filarial chitinases：an alternative view[J]. Parasitology Today，1996，12(7)：291.

[14]Hollis T，Monzingo A F，Bortone K，et al. The X-ray structure of a chitinase from the pathogenic fungusCoccidioidesimmitis[J]. Protein Science，2000，9(3)：544-551.

[15]Arimori T，Kawamoto N，Shinya S，et al. Crystal structures of the catalytic domain of a novel glycohydrolase family 23 chitinase fromRalstoniasp. A-471 reveals a unique arrangement of the catalytic residues for inverting chitin hydrolysis[J]. Journal of Biological Chemistry，2013，288(26)：18696.

[16]Li H，Greene L H. Sequence and structural analysis of the chitinase insertion domain reveals two conserved motifs involved in chitin-binding[J]. PLoS One，2010，5(1)：e8654.

[17]Arakane Y，Zhu Q，Matsumiya M，et al. Properties of catalytic，linker and chitin-binding domains of insect chitinase[J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology，2003，33(6)：631.

[18]张丹丹，刘廷辉，赵 丹，等. 球孢白僵菌胞外酶的活性与其毒力的相关性[J]. 江苏农业科学，2017，45(2)：93-95.

[19]刘蒲临，程德勇，缪礼鸿. 产几丁质酶侧孢短芽孢杆菌M64的产酶条件优化及部分酶学性质研究[J]. 江苏农业科学，2016，44(10)：468-471.

[20]Arnold K，Brydon L J，Chappell L H，et al. Chitinolytic activities inHeligmosomoidespolygyrusand their role in egg hatching[J]. Molecular and Biochemical Parasitology，1993，58(2)：317-323.

[21]Adam R，Kaltmann B，Rudin W，et al. Identification of chitinase as the immunodominant filarial antigen recognized by sera of vaccinated rodents[J]. Journal of Biological Chemistry，1996，271(3)：1441-1447.

[22]Khan A，Williams K L，Hkm N. Effects of paecilomyces lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and hatching ofMeloidogynejavanicajuveniles[J]. Biological Control，2004，31(3)：346-352.