干制辣椒InDel-PCR反应体系的构建及应用

王 辉， 王 爽， 姜 童， 杨延杰， 林 多

(青岛农业大学园艺学院/青岛市遗传改良与育种重点实验室，山东青岛 266109)

辣椒(CapsicumannuumL.)属茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)，是一年生或多年生草本植物[1]。干制辣椒作为辣椒的重要种类之一，是辣椒产业化生产的主要原料，在辣椒产业中占据重要的位置[2]。我国是仅次于印度的世界干制辣椒第二大出口国，干制辣椒作为我国的传统出口创汇品种，适种区域广，经济效益高，加工增值潜力大[3]，产业链长，尤其是西北、西南、华北重要的特色经济作物，全国有20多个地区将干制辣椒作为当地的主要产业。

InDel(insertion-deletion)是针对基因组中插入缺失位点而设计的PCR标记，广泛分布于基因组中[4-5]。InDel标记具有带型简单、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易的特点。应用InDel标记技术，可在材料间亲缘关系分析、关键基因资源拓宽、遗传群体评价等方面进行高效研究，进而为快速高效选育优良杂交组合奠定基础。目前，在水稻[6]、玉米[7]、番茄[8]、黄瓜[9]等作物的种质资源遗传多样性和亲缘关系等研究领域已有关于InDel标记技术的研究，但对于干制辣椒InDel标记的研究尚未见报道。

InDel-PCR反应体系构建是InDel标记的研究基础。在进行InDel-PCR扩增时，不同模板材料所要求的反应条件不同，扩增结果易受反应条件中诸多因素的影响[10]，为保证InDel标记的准确性和重复性，建立和优化InDel-PCR反应体系十分必要。本试验以干制辣椒为材料，筛选适用于InDel-PCR的DNA提取方法，对PCR反应条件中模板DNA浓度、引物浓度和循环次数进行优化，以建立干制辣椒 InDel-PCR 反应的最佳体系，并进一步进行InDel引物筛选。

1 材料与方法

1.1 试验材料

干制辣椒试验材料由青岛农业大学园艺学院干制辣椒育种课题组提供，随机选取4份干制辣椒材料进行干制辣椒基因组DNA的提取；选用簇生朝天椒三樱椒进行InDel-PCR反应体系的构建；随机选取其他8份干制辣椒材料进行干制辣椒InDel引物的筛选。

引物设计参照Li等开发的辣椒InDel引物[11]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 干制辣椒基因组DNA提取 采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和植物基因组DNA提取试剂盒法2种方法，分别提取干制辣椒材料DNA。采用琼脂糖凝胶电泳、InDel-PCR 扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的DNA进行检测。

改良CTAB法参考Li等的方法[11]，并对取样和研磨过程进行一定的改良，具体步骤如下：(1)取样，在新鲜叶片上取直径2 cm的小片，加入2 mL离心管中；(2)研磨，向离心管中加入液氮，用玻璃棒充分研磨至粉末状。

植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，按说明书步骤提取干制辣椒植物基因组DNA。

1.2.2 InDel-PCR反应程序的建立 设定PCR基本扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s；72 ℃延伸5 min。

PCR反应体系循环数设置25、30、35、40次4个梯度，其余条件不变。

1.2.3 InDel-PCR扩增反应体系的优化 选用InDel标记CIDH28为扩增引物进行扩增，设定PCR基本反应体系：总体积15 μL，含模板DNA 3 μL，2×GoTaqR Colorless Master Mix 7.5 μL，正反向引物各1.0 μL，用ddH2O补齐至15 μL。模板DNA设置0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μL 5个梯度，正反向引物设置0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 μL 5个梯度，在保持其他因素一致的条件下，变化单一因子，每次都将上一个筛选到的某个因素的最佳值作为固定值使用到下一个因素筛选中，筛选最优参数。取2 μL PCR产物，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.2.4 InDel引物的筛选 利用构建的InDel-PCR扩增程序和体系对8份样品进行PCR扩增，参照Li等开发的辣椒InDel引物[11]对随机挑选的60对覆盖12条染色体的InDel标记进行多态性筛选。用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测分析，筛选条带清晰、多态性高、重复性好的引物。

2 结果与分析

2.1 DNA提取检测

由图1的2种方法提取的干制辣椒基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果可见，2种方法提取的DNA条带均清晰整齐、完整无杂带，其中改良CTAB法提取的DNA亮度明显高于试剂盒法，说明改良CTAB法提取的DNA浓度高于试剂盒法；试剂盒法提取的DNA只有少量点样孔有杂质，改良CTAB法提取的DNA点样孔内普遍存在杂质，且有拖尾现象，说明试剂盒法提取的DNA纯度高于改良CTAB法。

由图2-A可以看出，以2种方法提取的DNA样品为模板进行InDel -PCR扩增，产物条带清晰，说明2种方法提取的DNA均可满足干制辣椒InDel-PCR扩增需要。

2.2 干制辣椒InDel-PCR反应体系的构建与优化

设计25、30、35、40次4个循环数梯度，由图2-B可知，25次循环扩增结果出现条带缺失，不能满足InDel分子标记的需要；30、35、40次循环扩增结果均条带清晰，且不同循环数间无明显差异，表明在30次循环时已达到饱和状态。为节省试验时间，减少非特异性扩增的影响，应选择30次循环。

适宜的模板量是保证特异性扩增和扩增产物足量的前提。由图2-C可知，当DNA用量为0.5 μL时，无扩增条带，当DNA用量为1.0～4.0 μL时，电泳带型无明显差异，均可满足试验需要。结合节约试验材料和保证扩增效果两方面考虑，本试验选择模板DNA量为2.0 μL，经计算，其浓度约为30 ng/μL。

引物量对扩增效果的影响如图2-D所示，引物用量在0.50、0.75 μL时，扩增不完全，谱带数量少；当引物用量增至1.00～1.50 μL时，谱带清晰稳定，且条带之间无明显差异。为节约试验成本，引物量选择1.00 μL即可满足试验需要，其浓度约为0.67 μmol/L。

2.3 干制辣椒InDel-PCR反应体系的验证和引物筛选

选用引物CIDH293、CIDH267对构建的InDel-PCR反应体系进行验证，由图3可以看出，所有材料均能扩增出清晰的条带且多态性好、稳定性高，说明构建的InDel-PCR反应体系适用于干制辣椒InDel分析。对60对InDel引物进行PCR扩增，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。试验结果表明，其中25对引物具有多态性，2对引物无扩增产物，其余引物无多态性。检测引物在目标群体中的InDel等位基因数，共产生57个等位基因标记，其中7对InDel引物检测到3个等位基因，其他18对引物均为2个等位基因。部分引物的筛选结果如图4所示，可见引物CIDH908、CIDH426有多态性扩增，引物CIDH552、CIDH49无多态性扩增。

3 讨论

InDel标记带型简单、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易，与其他分子标记相比，在基因组的同一位置出现相同大小的InDel标记的概率非常低，从而避免了统计重复的问题[12]。利用InDel标记进行作物种质资源遗传多样性分析，大大提高了遗传分析的重现性、准确性和分辨率，可解决育种过程中存在的引种中品种名称混乱、种质资源整理困难、育种材料间遗传重复度高、新品种突破困难等问题。

提取高纯度的模板DNA是进行InDel-PCR的前提，最经典的DNA提取方法是CTAB法，CTAB法具有得率高、稳定性好、费用低等优点，但其操作步骤繁琐、耗时，所用药品中的异丙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等对人体毒性很大。相较之下，植物基因组DNA提取试剂盒成本较高，但操作简单、纯度高、毒害少，因此应用越来越广泛[13-14]。

试验结果表明，2种提取方法提取的DNA均可满足InDel-PCR的需要，利用植物基因组试剂盒法所提取DNA较改良CTAB法质量高、杂质少，但DNA得率略低，因此在模板DNA需求量小时优先使用植物基因组试剂盒提取DNA，需求量较大时，可以采用改良CTAB法。此外，在干制辣椒DNA提取过程中，研磨技术会对DNA的提取造成很大影响，因此在研磨过程中，动作必须迅速，防止材料褐化；同时在水浴提取过程中应多次轻轻振荡离心管，使其充分混匀，以提取充分。

InDel-PCR扩增受到多因素影响与多个因子的综合作用。模板DNA浓度过低，会造成没有扩增产物或条带不完全；模板DNA浓度过高，会增加反应体系中抑制反应的成分，出现非特异性扩增[15]。引物浓度对PCR的带型产生显著影响，浓度过低时扩增不完全，浓度过高时会导致引物二聚体的形成。循环次数是InDel-PCR扩增程序的关键因素，循环次数决定扩增产量，循环次数过少，扩增产物不足以满足电泳需要，次数过多，消耗反应物后，产物不会继续增加，反而会出现非特异性扩增，因此在有效范围内，应选择较少的循环次数[16-17]。

本试验通过单因素试验设计建立了干制辣椒InDel-PCR的最佳反应体系，通过验证，确认了其可行性，并进一步筛选出25对InDel引物。反应体系如下：总体积15 μL，模板DNA 2.0 μL，正反向引物各1.0 μL，2×GoTaqR Colorless Master Mix 7.5 μL，其余用ddH2O补齐。扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s(温度根据引物报告单Tm确定)，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。

参考文献：

[1]吴征镒，匡可任. 中国植物志 第67(1)卷[M]. 北京：科学出版社，2004.

[2]黄任中，黄启中，吕中华，等. 我国干制辣椒产业现状及发展对策[J]. 中国蔬菜，2015，2(2)：9-11.

[3]段韫丹，司智霞. 2013年我国蔬菜种子进口情况分析[J]. 中国蔬菜，2015，2(2)：6-9.

[4]Feltus F A，Wan J，Schulze S R，et al. An SNP resource for rice genetics and breeding based on subspecies indica and japonica genome alignments[J]. Genome Research，2004，14(9)：1812-1819.

[5]冯芳君，罗利军，李 荧，等. 水稻InDel和SSR标记多态性的比较[J]. 分子植物育种，2005，3(5)：725-730.

[6]姚国新，黄文超. 利用水稻籼粳分化InDel标记鉴定育种材料的籼粳属性[J]. 杂交水稻，2013，28(3)：53-57.

[7]葛 敏，蒋 璐，张晓林，等. 利用Insertion/Deletion(InDel)分子标记检测玉米互交种混杂的原理及应用[J]. 分子植物育种，2013，11(1)：37-47.

[8]申 璐，沈火林，柴 敏，等. 采用InDel和SSR标记分析番茄品种基因组DNA多态性[J]. 中国农业大学学报，2011，16(2)：34-42.

[9]李斯更，沈 镝，刘 博，等. 基于黄瓜基因组重测序的InDel标记开发及其应用[J]. 植物遗传资源学报，2013，14(2)：278-283.

[10]梁 爽，原玉香，张晓伟，等. 大白菜InDel-PCR反应体系的优化[J]. 河南农业科学，2012，41(9)：110-113.

[11]Li W P，Cheng J，Wu Z，et al. An InDel-based linkage map of hot pepper (Capsicumannuum)[J]. Mol Beeding，2015，35(1)：32.

[12]高 颖，罗双霞，王彦华，等. 大白菜抽薹开花时间与SSR和InDel标记的关联分析[J]. 园艺学报，2012，39(6)：1081-1089.

[13]梁玉琴，李芳东，傅建敏，等. 柿属植物基因组DNA提取方法比较[J]. 中南林业科技大学学报，2012，32(4)：170-173.

[14]王 茜，廖惠红，黄宏明，等. 柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较[J]. 南方农业学报，2013，44(2)：225-229.

[15]郑道君，谢良商，曾建华，等. 海南龙血树ISSR-PCR反应体系建立与有效引物筛选[J]. 热带亚热带植物学报，2011，19(2)：177-183.

[16]王东娜，牟长城，冯富娟. 胡桃楸ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 实验室研究与探索，2010，29(11)：18-22，37.

[17]李房英，黄彦晶，吴少华. 三角梅ISSR反应体系的建立和优化[J]. 海峡科学，2010(10)：216-219.