肝癌组织中抗凝血酶Ⅲ基因表达的临床意义

文娟娟 瞿 兵 刘 超

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率占恶性肿瘤死亡率的第二位[1-2]。肝癌起病隐匿，大多数患者初次诊断时，便已进入中晚期，预后较差。对于未转移病例，手术切除和肝移植是肝癌根治的主要治疗方法。肝癌发生发展机制已研究多年，但发病机制仍不清楚。肝炎病毒感染、长期饮酒等因素导致的多基因异常与肝癌的发生发展密切相关[3]。因此，从基因水平研究肝癌病理机制对明确肝癌发病、提高早期诊断率、寻找治疗靶点、改善预后至关重要。抗凝血酶Ⅲ(Antithrombin-Ⅲ，AT3)，又称作丝氨酸蛋白酶抑制剂C家族成员1(Serpin family C member 1，SERPINC1)，是血浆中一种蛋白酶抑制剂，具有抗凝血功能。研究报道，手术前AT3水平与肝癌根治性切除术后的生存率密切相关，且给予AT3可以降低肝癌切术术后肝衰竭发生率[4-5]，提示AT3可能参与了肝癌的病理机制。目前，尚无研究系统论述肝癌组织中AT3表达的临床意义。为此，本研究利用公共数据库中肝癌基因表达谱及相应临床数据，探讨肝癌组织中AT3表达水平与其临床特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 收集数据资料

从GEO(Gene Expression Omnibus)公共数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中下载肝癌基因表达谱及相关临床数据(GSE14520)。GSE14520包含两个芯片平台，分别为Affymetrix HT Human Genome U133A Array(GPL3921)和Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array(GPL571)。应用GPL3921和GPL571平台检测肝癌组织的病例数分别为220例和22例。所有标本提取RNA后，经过生物素标记后与芯片杂交，采用GeneChip scanner 3000扫描，应用GCOS1.0进行初步分析。本研究为了排除平台差异，仅选用GPL3921平台检测的220例肝癌数据。

1.2 数据筛选及分组

220例肝癌病例中，排除6例临床数据缺失的病例，保留214例临床数据完整的病例。临床数据中，所有病例的肿瘤转移风险是根据其标本中分子指纹(Gene signature)的表达情况来确定，该分子指纹是由Roessler等发现的161个基因的表达谱所组成[6]。基因表达谱中，所有基因的相对表达量均以探针信号强度以2为底数对数化后的值衡量。AT3基因对应的检测探针为210049_at，为特异性探针。根据探针号，提取214例样本对应的AT3基因表达数据，然后根据该基因的表达水平进行由高到低排序后，前50%的样本(n=107)作为高表达组，后50%的样本(n=107)作为低表达组。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件和GraphPad 5进行统计学分析，计数资料的单因素分析采用卡方检验。生存资料的单因素分析采用Log-rank检验，多因素分析采用Cox回归分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

共214例肝癌病例纳入研究，平均年龄50.7岁，男性占86.4%(185/214)，97例(45.3%)血清甲胎蛋白含量大于300 ng/mL，87例(40.7%)病例血清谷丙转氨酶(ALT)含量大于50 U/L，77例(36.0%)肿瘤直径大于5 cm，44例(20.6%)多发结节，197例(92.1%)合并肝硬化，TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别有89、77、48例(41.6%、36.0%、22.4%)，103例(48.1%)具有转移高风险。

2.2 肝癌组织AT3基因表达水平及其与临床特征的关系

单因素分析发现，AT3低表达组中，血清AFP含量较高(P<0.001)，肿瘤体积较大(P=0.015)，TNM分期较差(P=0.001)，转移风险较高(P<0.001)，而年龄、性别、血清ALT含量、结节数目、合并肝硬化等因素与AT3基因表达水平无显著性关系(P>0.05)(表1)。

2.3 肝癌预后影响因素分析

214例患者中位随访时间为51.5个月，共84例患者死亡。单因素生存分析发现，肿瘤体积较大(P=0.023)、多发结节(P=0.047)、合并肝硬化(P=0.016)、TNM分期较差(P<0.001)、高转移风险(P=0.001)及AT3低表达(P=0.005)与肝癌患者预后有关(图1，表2)。多因素Cox回归分析亦提示AT3表达水平是肝癌患者预后的独立影响因素(HR=0.850，95%CI：0.745～0.970，P=0.016)(表3)。

图1 肝癌组织中抗凝血酶III基因不同表达水平的生存曲线Figure 1 Survival curves of HCC patients with low or high expression of AT3

表1 肝癌组织抗凝血酶III基因(AT3)表达水平及其与临床特征关系

Note：AFP：alpha-fetoprotein；ALT：alanine aminotransferase.

表3 肝癌预后影响因素的多因素分析

表2 肝癌预后影响因素的单因素分析

3 讨论

抗凝血酶Ⅲ基因又称作丝氨酸蛋白酶抑制剂C家族成员1(Serpin family C member 1，SERPINC1)，位于人第1号染色体q25.1区域，由八个外显子构成。该基因编码的蛋白质含416个氨基酸，是血浆中一种蛋白酶抑制剂，可以抑制凝血酶和凝血系统中其它激活的丝氨酸蛋白酶，调控凝血与抗凝血平衡。基因本体发现，该基因不仅能抑制内肽酶活性，还可以结合蛋白酶、肝素、黏多糖以及含硫化合物，主要参与凝血相关生物过程，也参与炎症反应的调节。

目前，关于AT3的研究主要集中在凝血系统疾病，在肝癌中研究不多。Asmal等发现AT3可以抑制感染细胞株的丙肝病毒，同时下调与肝硬化、肝癌相关的多个宿主细胞信号转导因子，包括Jun、Myc和BMP2[7]。Mizuquchi等对158例首次肝癌切除术后的患者进行回顾性分析后发现，与ICGR15相比，术前血清AT3水平对术后肝功能异常/肝衰竭更有预测价值[8]。Iwako等将440例肝癌根治性切除术患者根据术前血AT3活性分成高低两组(阈值70%)，分析发现术前AT3高活性组手术后，总体生存率和无病生存率均显著高于低活性组(P=0.005；P=0.011)，多因素分析亦提示相同结果[4]。Kuroda等对肝癌切除术后患者给予静脉AT3治疗后，与对照组相比，治疗组肝衰竭发生率显著低于对照组(16.3%vs. 44.2%，P<0.01)[5]。相关研究报道显示血清AT3水平下降是结肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤复发和预后的危险因子[9-10]。这些研究均提示AT3在肝癌中可以起到抑癌作用，与本研究结论一致。

关于AT3在肿瘤中的作用机制较为复杂。有研究报道AT3与肿瘤的浸润和转移相关。Kurata等发现在结肠癌大鼠模型中，AT3可以阻止肝缺血再灌注导致的结肠癌细胞转移[11]。AT3在肝癌中的作用机制主要与调控其靶点蛋白的肿瘤生物学活性相关。首先，巨噬细胞抑制因子(Macrophage inhibitory factor，MIF)是AT3的作用靶点之一，参与了多种肿瘤细胞的增殖和浸润，而AT3可以通过与MIF形成复合物来降低MIF的生物活性[12]。其次，AT3的另一底物凝血酶可促进多个肿瘤相关病理过程，如肿瘤细胞-血小板黏附、肿瘤细胞组织浸润和肿瘤血管生成等[13]。Kaufmann等[14]研究发现多种肝癌细胞系表达凝血酶受体，加入凝血酶后可以促进肝癌细胞迁移。第三，骨桥蛋白在肝癌细胞中高表达，并与肝癌的预后、早期复发和转移密切相关[15]。凝血酶可将骨桥蛋白分解成两个相同大小的片段，这些片段可以通过激活整合素β-黏着斑激酶信号通路，促进肝癌细胞的增殖和黏附[16]。因此，AT3可以通过抑制凝血酶来调控肝癌的发生发展。

本研究通过公共数据库中基因芯片的肝癌表达谱数据及相应临床数据进行分析，确认了AT3表达在肝癌中的临床意义。研究发现，AT3在肝癌中可能起到抑癌基因作用，与相关基础研究结果一致，为该基因的进一步研究提供了理论基础，同时，也为该基因应用于精准医疗诊断和治疗提供了理论支持。其次，本研究共纳入了214例标本，样本量较大，临床信息较全，弥补了相关领域研究样本量小、临床信息缺失的不足。

综上所述，肝癌组织中，AT3表达水平与患者临床特征及预后相关，其低表达可能是影响肝癌预后的危险因素之一。

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