4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌的23S rRNA基因突变分析

林 贺， 薛 苗， 汪怀周， 黄晓春， 秦阳华

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院北院检验科，上海 201801；2.第二军医大学附属长海医院实验诊断科，上海 200433）

利奈唑胺是一种人工合成的噁唑烷酮类抗菌药物，通过与细菌核糖体50S亚基结合抑制转录的初始步骤起作用，对革兰阳性菌，包括耐青霉素的肺炎链球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP）、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和耐万古霉素的肠球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）都具有良好的抗菌作用。2000年利奈唑胺在美国首先上市，2007年开始在我国临床使用，对于治疗相关病原菌引起的感染发挥了巨大的作用。随着利奈唑胺在临床上的广泛使用，陆续出现了耐药菌株的报道，但目前其耐药率依然很低，临床上最常分离的耐药细菌为粪肠球菌，卫生部全国细菌耐药监测网（Mohnarin）2011—2012年革兰阳性菌耐药监测报告显示，只有0.4%的粪肠球菌对利奈唑胺不敏感[1]。肠球菌对利奈唑胺的耐药机制主要与其细菌核糖体23s rRNA区域碱基突变和/或携带含有氯霉素-氟甲砜霉素耐药（chloramphenicolflorfenicol resistance，cfr） 基因的质粒有关。本研究分析了近期从临床分离的4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌的耐药基因突变情况。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

菌株分离自上海交通大学医学院附属瑞金医院北院收治的4例患者的引流液和中段尿样本，其中3株菌对利奈唑胺耐药，1株菌对利奈唑胺中介，见表1。采用法国生物梅里埃公司生产的Vitek 2 Compact 全自动微生物分析系统及配套的鉴定卡（GP）和药物敏感性卡（GP-68）进行菌株鉴定及体外药物敏感性试验，采用E-test法确认利奈唑胺最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，质控菌株为粪肠球菌（ATCC 29212），体外药物敏感性试验结果根据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） M100-S26标准判读。

表1 4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌的基本情况

1.2 耐药基因扩增

粪肠球菌基因组含有4个23S rRNA拷贝基因，突变的数量和位置与其耐药程度有关，根据文献[2-3]设计合成聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物，23S rRNA V区靶基因引物、cfr基因引物、23S rRNA4个拷贝基因引物（表2）。扩增采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶（日本TaKaRa公司），PCR体系为：DNA模板1 μL，引物1 μL（前向和逆向引物各0.5 μL），PrimeSTAR预混液25 μL，加去离子水至50 μL。扩增条件：98 ℃10 s，55 ℃ 15 s ，72 ℃ 90 s，共30个循环，最后72 ℃延伸2 min。扩增后取5 μL于1%琼脂糖凝胶100 V电泳60 min，观察扩增结果，余下45 μL送生工生物（上海）有限公司测序。

1.3 序列分析

23s rRNA序列采用Invitrogen公司AlignX软件进行拟合和突变分析，参考序列为Enterococcus faecalisV583 （GB：AE016830）。

2 结果

2.1 23S rRNA 区和cfr基因的扩增

4株粪肠球菌均未扩增出cfr基因，23S rRNA V区扩增片段经胶回收和T载体克隆后随机挑选6个菌落抽提质粒测序，未检出最常见的G2576U突变。见图1。

表2 本研究所用的扩增基因的引物序列

图1 23S rRNA V区序列比对

2.2 基因组4个拷贝23S rRNA基因的扩增

对粪肠球菌基因组4个23S rRNA拷贝基因分别进行PCR扩增并测序，结果显示仅1株菌（1512104）存在G2576U突变，4株菌均存在U2826C突变，菌株1512160存在G2389A突变，菌株1512163存在U2363C和A2881G突变。见图2。

图2 4株粪肠球菌基因组23S rRNA序列比对

2.3 同期利奈唑胺敏感粪肠球菌4个拷贝23S rRNA基因的扩增

因为23S rRNA基因和野生型标准株V583相比出现的主要突变类型是U2826C，位于23S rRNA V区外围，本研究进一步扩增同期分离的对利奈唑胺敏感的3株粪肠球菌和标准株（ATCC 29212）。结果显示，3株临床分离的利奈唑胺敏感粪肠球菌和标准株（ATCC 29212）的23S rRNA基因第2826位均为胞嘧啶C。其余序列与野生型标准株 V583相比均无突变。见图3。

图3 3株利奈唑胺敏感粪肠球菌和标准株（ATCC 29212）的测序结果

3 讨论

抗菌药物耐药是全球性难题，可造成大量的社会卫生资源的浪费和人民生命财产的损失[4]。目前，细菌耐药现象日益严重，根据2015年全国细菌耐药监测报告，耐万古霉素粪肠球菌和屎肠球菌分别为0.4%和2.9%。利奈唑胺被认为是治疗VRE感染的理想药物。随着利奈唑胺在临床的大量使用，肠球菌对利奈唑胺耐药现象也渐有报道[5-7]，较明确的耐药机制主要涉及靶位突变、cfr的产生等。

本研究首先采用PCR进行检测，发现4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌均不含有cfr基因，推测其耐药的主要机制是23S rRNA发生耐药突变。进一步扩增23S rRNA V区并测序，并没有检测出文献报道的最常见的G2576U突变[7-10]。进一步分别扩增4个拷贝23S rRNA基因（图4）并测序，结果发现仅1株菌存在1拷贝G2576U，4株菌均存在U2826C突变，另外还分别存在G2389A、U2363C和A2881G突变，我们推测可能是U2826C突变导致了菌株对利奈唑胺不敏感。因为4株细菌16拷贝均出现U2826C突变，并且第2 826位碱基位于可变区的外围，可能是标准序列V583发生了无义突变，我们进一步扩增了同时期临床分离的对利奈唑胺敏感的粪肠球菌和标准株（ATCC 29212），结果其第2 826位碱基均为胞嘧啶，说明第2 826位可能野生型就是胞嘧啶，且突变不会对利奈唑胺的耐药性发生变化。很多体外试验和临床数据支持抗菌药物的选择压力促进耐药突变产生的观点[11-12]，但耐药突变的产生和使用利奈唑胺的关系并不确定，有未使用利奈唑胺的患者分离到耐药株的报道[13]，在我们分离的4例患者中有3例曾使用利奈唑胺，另1例未使用利奈唑胺为门诊患者。

已发现的粪肠球菌对利奈唑胺的耐药机制主要涉及23S rRNA突变，导致抗菌药物和靶位结合障碍，和其他抗菌药物不存在交叉耐药，我们分离的4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌均对万古霉素敏感。泰地唑胺是新的噁唑烷酮类抗菌药物，CLSI M100 S26增加了革兰阳性球菌泰地唑胺的MIC判断标准，美国食品与药品监督管理局也批准泰地唑胺用于治疗金黄色葡萄球菌（甲氧西林耐药菌株和甲氧西林敏感菌株）、各种链球菌及肠球菌等革兰阳性细菌引起的成人急性细菌性皮肤和皮肤组织感染。有报道显示，尽管与利奈唑胺作用机制相同，但利奈唑胺耐药并不表示泰地唑胺也耐药，而利奈唑胺敏感则提示泰地唑胺敏感[14]。因为缺乏泰地唑胺体外药物敏感性试验的检测药物，所以尚不清楚这4株菌是否对泰地唑胺不敏感。

体外试验显示，在长时间利奈唑胺的选择压力下，肠球菌23S rRNA基因会发生突变，且突变的拷贝数量会增加，细菌通过同源重组的方式，野生株的基因逐步被突变株的基因所取代，推断出现突变的拷贝数与耐药水平相关[11，15]。此次检测，虽然这3株菌分离自不同病区的患者，也没有直接证据表明是同源菌，但结合医院感染特点和药物敏感性谱分析不排除医院感染同源菌的可能，另1株分离自门诊患者。尚不清楚4个拷贝基因均发生突变的原因，有待进一步研究。

总之，我们分析了临床分离到的4株利奈唑胺不敏感粪肠球菌23S RNA基因的突变情况，结合同期分离的敏感株和质控菌株，发现耐药的主要原因是23S rRNA散发突变，提示我们应进一步加强抗菌药物合理使用管理和医院感染预防控制工作，防止多重耐药菌的出现和在医院蔓延。

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