CAP认可要求下SYSMEX XN-9000血液分析仪测定网织红细胞及其参数的性能验证与干扰因素研究

蒋浩琴，顾剑飞，陈 健，王 吉，王凯俊，吕 元

（复旦大学附属华山医院检验医学科，上海 200040）

网织红细胞（reticulocyte，RET）计数用于评估骨髓中红系增生活跃度已在临床上使用多年，在血液学检验中常使用新亚甲蓝（new methylene blue，NMB）染色的手工目视计数法。近年来，新一代采用流式细胞术原理检测RET的血液分析仪，能快速、准确地检测RET，并能提供更多RET特异性荧光参数，特别是未成熟网织红细胞指数（immature reticulocyte fraction，IRF），已成为骨髓和造血干细胞移植及化疗后骨髓再生的早期标志物[1-3]。有研究结果表明，与RNA结合使RET发出荧光的染料可能会对RET检测造成干扰，如使用某些药物或存在某些病理状态可能导致信号终止或自发荧光[1，4]。正式应用于临床前，我们对SYSMEX XN-9000血液分析仪检测RET及其荧光参数的精密度、携带污染率、可比性、线性范围、准确度、干扰因素等[5-6]进行了严格的方法学验证。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

SYSMEX XN-9000全自动血液分析仪和配套试剂、配套质控品（日本Sysmex公司），尼康双目显微镜（日本尼康公司），NMB染色剂（珠海BASO公司）。

1.2 定义

美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和国际血液学标准化委员会（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）的H44-A2 指导文件关于RET的定义[6]：介于有核红细胞和成熟红细胞中间的红细胞，当被活体染色剂（如NMB）染色时，含能被染色的核酸（细胞内RNA）或与特定的核酸结合且被荧光剂染色时，显示细胞内增高的荧光强度。需注意的是，采用显微镜检查RET时，细胞必须含有2个或2个以上深蓝色的颗粒（NMB-RET），并且清晰可见，无需显微镜对单个细胞特别聚焦调整即能发现其存在，这些颗粒应远离细胞边缘，避免与Heinz小体相混。

1.3 标本收集

用真空采血管（美国BD公司）采集乙二胺四乙酸二钾为抗凝剂的静脉血标本2 mL，采集对象为无任何基础疾病的体检人群，除参考区间验证外，其他用于方法学验证的采集对象为复旦大学附属华山医院门诊和住院患者。除稳定性试验外，其余检测均在标本采集4 h内完成。

1.4 仪器校准

方法学评估前，仪器已完成半年1次的校准和校准验证，校准精密度要求为变异系数（coefficient of variation，CV）＜2%[6]。

1.5 精密度验证

1.5.1 批内精密度 选择网织红细胞计数绝对值（reticulocyte absolute value，RET#）低值（＜10×109/L）、中值[（10～60）×109/L]、高值（＞200×109/L）[6]的静脉抗凝血各5份，每份连续测定11次，弃第1次结果，各自计算标准差（s）和CV[7]。网织红细胞计数百分比（reticulocyte percentage，RET%）和RET#的批内精密度要求CV≤5%[6]，荧光参数的批内精密度要求CV≤7.5%。

1.5.2 天间精密度 取近期连续2个批号的质控品，每个批号包括高、中、低值3个水平RET质控品，每天同一时间（±30 min以内）进行操作，连续观察20 d，计算s和CV值。Sysmex在线质控：计算组内所有仪器s的平均s值，然后判断每个仪器的s与平均s的比值即PI，以PI来反映各仪器精密度。

1.6 携带污染试验

选择红细胞计数高值（＞6.0×1012/L）和红细胞计数低值（＜2.0×1012/L）的标本进行红细胞携带污染试验，并选择RET#的高值（＞200×109/L）和低值（＜10×109/L）标本进行RET%和RET#携带污染试验。高值连续测3次，低值连续测3次。携带污染率（%）=（j1-j3）×100/（i3-j3）。式中i、j3分别是高值第一次、第3次的测定结果，i3是低值第3次的测定结果[6]。要求携带污染率＜2%[8-9]。

1.7 相关性比对分析（NMB染色目视计数法）

1.7.1 标本收集 常规验证至少检测40份标本[10]，但完整的验证应至少检测250～300份标本[7]，其中50%代表正常范围标本，50%代表异常范围标本（25%升高，25%降低）[6-7]。

1.7.2 染色与涂片准备 标本采集后2 h内进行NMB染色，然后制作至少2张血涂片，涂片要薄而均匀，红细胞不能重叠。染色良好的涂片中可见嗜多色性略带蓝色红细胞，其中可以看到深蓝色的颗粒或网状物质为RET[6，11]。

1.7.3 计数程序 手工NMB染色法镜检至少2 000个红细胞（每张血涂片至少1 000个红细胞），由2位从事临检专业的中级职称或高年资检验技师（至少从事血液专业10年以上）对至少2张涂片分别进行显微镜计数，取均值（x）作为手工镜检的RET%结果[6，11]。以手工镜检结果为靶值，将SYSMEX XN-9000血液分析仪检测的RET%结果（仪器做2次检测，取x ）与NMB活体染色显微镜计数x 结果进行比对。

1.8 线性范围验证

选择分析测量范围从最低到最高的各种稀释度，厂商提供线性范围为RET%（0%～30%）、RET#（0～720×109/L），用RET极低值标本将接近预期上限的RET高值标本分别作100%、80%、60%、40%、20%、10%稀释，每个稀释浓度重复测定3次，计算[6，8]。

1.9 准确度确定

手工法与仪器法比对及参加室间质评：以参考方法（NMB染色目视计数法）测定RET，每年参加美国病理家协会（the College of American Pathologists，CAP）RET室间质评（手工法）2次，已连续参加11年，合格率100%，以手工法检测RET%结果为靶值，取至少40份标本（含高、中、低值）进行仪器法与手工法比对，通过一致性检验，统计符合率、确定准确度（≥90%）。

1.1 0 正常参考区间验证

根据厂商提供的参考区间进行验证，首次验证应包括至少40份无基础疾病的体检标本（20名男性和20名女性），符合率＞90%为验证通过。验证不通过的参数需建立相应的参考区间，至少120名男性和120名女性，每组应计算、s和95%可信区间，按照Dixon法删除可能存在的离群值，若组内数据呈正态分布，则参考区间为1.96s，表示95%的可信区间分布；若数据不呈正态分布，则用百分位数法（P25和P97.5）确定参考区间[12]。

1.1 1 敏感性验证

选择一个正常或适度升高的标本（H），RET计数（约150×109/L），再选择1例RET计数最低（L）可接受（约5×109/L）的标本，不要使用冷凝集标本，在骨髓活性最低点的骨髓移植后标本为最优，其RET计数约为 0.1% 或更低。要求同线性验证要求[6]。

1.1 2 干扰评估

收集至少300份静脉血标本，覆盖各种影响因素和不同疾病种类，对可能存在的不同干扰因素进行分组并逐一进行一致性符合率分析，对不符合的病例进一步进行干扰研究。干扰因素主要有各种贫血，血小板增多症，红细胞增多症，淋巴细胞增多症，冷凝集，红细胞碎片，有核红细胞，传染性疾病如疟原虫感染，服用荧光类药物，RET%或RET#异常增高或降低，有异常RET、红细胞、血小板散点图和报警提示等[6]。

1.1 3 统计学方法

采用美国Stata 10统计软件进行数据处理。相关性比对、线性、敏感性验证采用相关性分析[6，8]，计算线性回归方程Yˆ=αX+b；相关性比对采用配对t检验，以p＜0.05为差异有统计学意义，并进行Bland-Altman一致性检验[7]。采用准确性和干扰研究判断一致性符合率，即计算手工法CV和仪器法CV，然后计算出标准误（SEp），符合率应≥90%，具体结果见表1。手工法CV计算公式为VarR=（pR×qR）/nR，式中VarR为手工法CV、pR为手工法RET%、qR=1－pR、nR为手工法红细胞总数；仪器法CV计算公式为VarFC=（pFC×qFC）/nFC，式中VarFC为仪器法CV、pFC为仪器法RET%、qFC=1－pFC、nFC为仪器

2 结果

2.1 批内和天间精密度

高、中、低值标本RET%、RET#、IRF、低荧光强度网织红细胞比率（low fluorescence reticulocyte，LFR）、中荧光强度网织红细胞比率（medium fluorescence reticulocyte，MFR）、高荧光强度网织红细胞比率（high fluorescence reticulocyte，HFR）的批内和天间精密度均符合要求。

2.2 携带污染率

RET%为0.29%，RET#为0.38%，红细胞计数绝对值为0.22%，均符合携带污染率要求。

2.3 相关性比对

手工法和仪器法检测400份静脉血标本的相关性比对呈线性相关（r2=0.972 4），线性回归方程式为Yˆ=0.950 7X+0.160 8（图1）。配对t检验，P=0.006 8；Bland-Altman一致性检验（图1），P=0.068，2种方法检测RET%结果差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 线性范围验证

RET%的直线相关回归分析Yˆ=1.004 5X+0.195 8（r2=0.998 8），RET#（×109/L）的直线相关回归分析，Yˆ=1.020 9X+3.184 5（r2=0.993 9）。

表1 准确度评估表

图1 手工法与仪器法RET%结果比对

图2 仪器法检测RET%线性范围验证

2.5 准确度确定

手工法与仪器法的验证结果根据准确度评估表（表1），统计一致性符合率为91.7 %。Sysmex在线质控系统（Sysmex network communication system，SNCS）在线质控评估对RET及其参数的准确度评价全部合格。参加上海市临床检验中心RET（仪器法）室间质评，各项参数结果均合格。已参加CAP室间质评RET RT系列（手工法）连续11年，成绩全部合格。

2.6 参考区间确立

根据对厂商RET%和RET#的参考区间验证，符合率均≥90%，通过验证。其他RET参数的厂商范围未通过验证，因此建立了实验室自己的范围。IRF、LFR、MFR呈正态分布（P＞0.05），HFR呈偏态分布（p＜0.05）。见表2。

表2 RET参考区间验证与自建范围建立

2.7 RET%和RET#敏感性验证

RET%敏感性的直线相关回归方程为Yˆ=1.115 4X-0.081 4（r2=0.993 8）。（2）RET#（×109/L）敏感性直线相关回归方程为Yˆ=1.040 9X-1.075 9（r2=0.983 1）。

2.8 干扰评估

508例病例分析中，我们发现疟原虫和荧光类药物等影响因素对RET结果产生严重干扰，引起RET%假性增高，并且严重干扰的病例都出现RET异常散点图报警提示，疟原虫病例中还出现了疟原虫感染的报警信息。2例疟原虫病例中，例1患者为恶性疟感染者，外周血涂片红细胞感染率为20%，以大量环状体和少量裂殖体为主，治疗前仪器法RET%为8.5%，手工法RET%仅0.5%，治疗后仪器法RET%结果逐渐下降，完全治愈后与手工法结果一致。例2患者为恶性疟感染者，外周血涂片红细胞感染率为1%，以少量配子体和环状体为主，治疗前仪器法RET%为4.6%，手工法RET%为3.9%，略有干扰，治愈后与手工法结果一致。疑似荧光药物干扰病例中，仪器法RET%为16.7%，手工法RET%仅0.9%，同一病例连续追踪数次，结果均类似，排除其他干扰因素后，病史显示患者先后服用过10余种抗菌药物和可疑荧光药物。

在引起RET%假性增高的影响因素分组统计中，除疟原虫和荧光类药物严重干扰RET结果外，红细胞、血小板增多，红细胞碎片、有核红细胞等干扰因素的存在均能导致RET计数结果的假性增高（p＜0.05）。引起RET%假性增高的干扰因素分别为有核红细胞（18.5%）、红细胞增多症（13.3%）、淋巴细胞增多症（12.8%）、血小板增多症（10.5%）、红细胞凝集/冷凝集（9.5%）、Howell-Jolly小体（7.7%）、白细胞增多症（6.7%）、血小板聚集（5.9%）、巨大血小板（5.6%）和红细胞碎片（2.9%），其他如嗜碱性点彩红细胞、帕彭海默小体等也会影响RET计数的结果。这些影响因素的干扰程度取决于干扰物的浓度和/或数量。

3 讨论

RET及其参数在临床的应用特别是对骨髓造血功能的评估和监测非常重要。本研究发现SYSMEX XN-9000血液分析仪对RET及其参数的检测性能良好，但在临床应用中仍需结合病史、仪器报警信息和血涂片镜检等及时发现和纠正可能存在的干扰。

在临床工作中，我们可以通过观察仪器的状态是否正常（如吸样问题）、Flag直方图、异常散点图或报警提示（尤其是疟原虫感染报警和RET异常散点图报警，后者在严重干扰病例中均有出现）、平均红细胞血红蛋白浓度异常增高（＞360 g/L常提示可能存在冷凝集现象[2]，可37 ℃孵育或采用XN系列RET通道的红细胞-O参数来及时纠正RET#的计数）、血涂片染色显微镜检查、结合病史或历史结果核查等发现可能存在的干扰，并且用仪器自动复检、手工法复查等方法进行及时的纠正，以保证RET检测的准确性和可靠性。

目前，系统评估和报告流式细胞术检测RET的完整方法学评估，包括对干扰因素的研究，国内外研究均较少。CAP最新checklist条款中对于仪器法检测RET提出了明确的要求，开展前需要评估干扰因素。对仪器的方法学评估既保证了RET检测结果的可靠性，又能指导如何去发现和及时纠正可能存在的干扰。本研究中准确性和干扰因素病例研究既覆盖了临床实际检测RET计数的全线性范围，还包括了超线性浓度水平，也包含了一些异常细胞或其他可能干扰RET计数的血液成分或疾病，如大量的Howell-Jolly小体、疟原虫感染、淋巴细胞增多症、血小板增多症或红细胞增多症、血小板聚集、嗜碱性点彩红细胞、大血小板、红细胞碎片、有核红细胞、帕彭海默小体、自发荧光类药物、冷凝集等，其中疟原虫感染病例中，由于感染的红细胞内环状体含RNA物质，因此外周血中大量环状体的存在对RET检测影响较大，而配子体等相对影响较小，并且对RET检测的干扰程度也取决于红细胞内的感染程度和状态。由于本研究中疟原虫病例较少，分析可能有一定的局限性。

另有文献报道如使用某些药物可能导致荧光信号终止（如蒽环类药物）或某些病理状态（如巴贝西虫等其他胞内寄生虫感染、卟啉症、Heinz小体、异常红细胞等）均会干扰RET的检测结果[1，6]。由于全自动血液分析仪检测RET可能的干扰因素众多，本研究未能对覆盖全部的干扰因素作一一研究，在后续临床实践中我们将持续跟踪研究，包括对已知重要干扰因素增加病例继续研究和分析，为临床疾病诊断和检测提供更可靠的数据和信息。

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