用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用

安韶雅,虎 娟,张 虹,孙 放,马 霞,王 晨,陈 任

(1.宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川750021;2.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川750021;3.宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川750021)

自1984年首次获得转基因烟草[1]以来,以转基因技术为代表的植物基因工程技术的广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。转基因技术通过将人工分离和修饰过的基因(包括来源于不同物种甚至人工合成的基因)导入到生物体基因组后,借助导入基因的表达,引起生物体性状发生可遗传的改变,在一定程度上有效提高目标性状改良的效率和准确性,从而实现由表型选择到基因型选择的过渡,大大加快了新品种培育进程。

在基因工程的研究与应用过程中,基因克隆、载体构建是必需的常规步骤。采用合适的表达载体和构建方法会使实验效果事半功倍。但是,目前常用于植物基因表达载体构建的质粒载体,如pBIN19[2]、pBI121[3]、pIG121-Hm[4]、pMSIsGFP[5]和pCAMBIA系列[6]等,由于其T-DNA区段中限制性内切酶位点有限,外来基因片段难于插入和连接,有时还需要构建多个中间载体,操作比较麻烦,而且这些经典的质粒载体,有些只限于在研究者同行间互相转让,没有商业化;有些由于专利限制,只能在研究和实验等非经营目的的小范围内使用,基因转化后的新品种(系)无法在生产上推广应用。因此建立一个简单高效的、专门用于植物基因表达载体构建的质粒载体具有现实意义。

为解决上述问题,本研究利用实验室现有的经大肠杆菌(Escherichia coli)质粒pUC18[7]改造的pKAFCR1和经双核农杆菌 (Agrobacterium tumefa ciens)Ti(tumor inducing)质粒pBI121改造的pKAFCR100两种质粒[8],在pKAFCR1的CaMV 35S启动子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(nopaline synthase terminator)之间,引入多克隆酶切位点MCS(multiple cloning site),然后将包含35S-MCS-NOS的片段切下来连接到pKAFCR100,使其成为一个用于构建植物基因表达的质粒载体pNULPGE200。

1 材料与方法

1.1 实验材料

pKAFCR1和pKAFCR100质粒(宁夏大学植物基因工程研究室,专利号CN201610767834.4)[8];LB培养基(北京索莱宝科技有限公司);植物生长调节剂、抗生素和MS培养基等(Sigma-Aldrich公司,美国);各种限制性内切酶(Takara公司,日本);凝胶回收试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit、PCR产物纯化试剂盒QIAquick PCR Purification Kit、质粒提取试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司,德国);质粒连接试剂盒Ligation High Kit、DNA平滑化试剂盒Blunting High Kit(Toyobo公司,日本);植物基因组DNA提取试剂盒Plant Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司);PCR试剂盒Ex-Taq PCR(Takara公司,日本);大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105感受态细胞(上海迈其生物科技有限公司)。

1.2 pKAFCR1质粒多克隆酶切位点MCS的改造

利用限制性内切酶XbaI和SacI对pKAFCR1进行双酶切处理;经1%的琼脂糖凝胶电泳分离后,切取目的条带,通过凝胶回收试剂盒回收获得已切除XbaI-SacI小部分的pKAFCR1。人工合成两条单链DNA(CR1 MCS Adapter-S、CR1 MCS Adapter-A,表1),采用温度梯度退火法使两条单链DNA构成一条双链DNA接头,该接头含有限制性内切酶XbaI、HpaI、PacI、SmaI(XmaI)、StuI、KpnI、XhoI 和SacI位点;利用质粒连接试剂盒将该接头与切除XbaI-SacI小部分的pKAFCR1进行连接;利用热激法将连接后的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中;将转化后的大肠杆菌平涂于含有25 mg/L青霉素的LB固体培养基上,37℃黑暗培养12 h后,挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定(采用CR1 35SHind-S、CR1 MCS Adapter-A,CR1 35SHind-S、CR1 NOSEcoR-A引物,表1),筛选含有重组质粒的阳性菌落;利用质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA,将该重组质粒命名为pKAFCR1+MCS。利用M13-F、M13-R引物(表1)对该重组质粒进行双向测序验证。

1.3 pNULPGE200质粒载体的构建

利用限制性内切酶HindⅢ和StuI,对pKA-FCR100进行双酶切处理。通过凝胶电泳分离、回收,获得双酶切后的pKAFCR100;同样利用限制性内切酶HindⅢ和PvuⅡ,对pKAFCR1+MCS进行双酶切处理,通过凝胶电泳分离、回收后获得包含35S-MCS-NOS片段。利用质粒连接试剂盒将35S-MCS-NOS片段与酶切后的pKAFCR100进行连接、大肠杆菌转化,用含有50 mg/L卡那霉素的LB培养基筛选,菌落PCR鉴定(采用CR100 Hind35SS、CR100 omega-A,CR100 Hind35S-S、CR1 Adapter-A,GFP-F、GFP-R,NPT-F、NPT-R引物,表1)。将所获重组质粒命名为pNULPGE200。利用CR100 Hind35S-S、CR100 omega-A 引物(表1)对pNULPGE200进行双向测序验证。

1.4 pNULPGE200在植物基因表达载体构建中的应用

参照NCBI等数据库公开的假单胞菌(Pseudomonas putida)携带质粒的二甲苯单加氧酶(xylene monooxygenase,PpXylM+XylA)编码基因(E02361)的序列,经密码子优化后人工合成DNA片段(2 312 bp),同时在5’和3’端分别引入PacI和KpnI酶切位点序列(共2 326 bp)。利用限制性内切酶PacI和KpnI,对pNULPGE200和人工合成DNA片段进行双酶切处理,凝胶电泳分离回收后进行连接、大肠杆菌转化、卡那霉素筛选和菌落PCR鉴定(采用 PpXylM-S、PpXylA-A,GFP-F、GFP-R,NPT-F、NPT-R引物,表1),将获得的基因表达载体命名为pNULPGE04101。

为了对比实验,以同样方法,首先将经PacI和KpnI双酶切处理后的人工合成PpXylM+XylA基因片段(共2 326 bp)与同样酶切的pKAFCR1+MCS(3 793 bp)进行连接,构建一个过渡载体,使PpXylM+XylA基因片段的上下游分别加上35S和NOS。然后利用限制性内切酶PvuⅡ处理,切下含有35S-PpXylM+XylA-NOS的片段,与经限制性内切酶SbfI单酶切、DNA平滑化试剂盒处理的pBI121[3]连接,获得的对照载体命名为pBI121-PpXylM+XylA。利用 PpXylM-SS、PpXylM-SA 引物(表1)对 pNULPGE04101、pBI121-PpXylM+XylA进行双向测序验证。

利用质粒提取试剂盒分别从大肠杆菌DH5α提取pNULPGE04101和pBI121-PpXylM+XylA两种载体DNA,分别取适量(＜1 μg)并利用热激法转化到农杆菌EHA105菌株的感受态细胞中,同样进行菌落PCR鉴定后,保存阳性菌液。阳性菌液可以用于植物基因转化。

以上所有具体操作步骤均按照试剂盒的使用说明进行。

1.5 pNULPGE200构建的基因表达载体在植物基因转化中的应用

以实验室培育的白色矮牵牛(Petunia hybrid)无菌苗的叶片为材料,用含有上述构建的质粒pNULPGE04101以及对照质粒pBI121-PpXylM+XylA的农杆菌EHA105进行基因转化。选用长势良好的叶片,切成约5 mm大小的方块,在OD550=0.25浓度的农杆菌中侵染,于22℃、黑暗条件下共培养3 d后,移至 25 ℃、有效光量子密度 30 μmol/(m2·s)、光照16 h/d条件下进行愈伤组织、不定芽、不定根诱导和筛选(表2),培育转基因植株。农杆菌感染、基因转化、sGFP荧光观察和GUS(β-glucuronidase)分析等操作均按照实验室以往的方法[9,10]进行。采取各转基因植株的叶片80～100 mg,利用植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA,进行PCR鉴定,采用 PpXylM-S、PpXylA-A 为引物(表1)。

2 结果与分析

2.1 pKAFCR1质粒多克隆酶切位点MCS的改造及鉴定

pKAFCR1(3 796 bp)经XbaI和SacI双酶切处理后,凝胶电泳分离回收获得已切除XbaISacI(1 265～1 294)部分的 pKAFCR1(3 766 bp,图1A)。将其与人工合成DNA接头(48 bp)连接形成的重组质粒pKAFCR1+MCS(3 814 bp)转化到大肠杆菌后,经菌落PCR鉴定,确认电泳条带正确(954 bp,1 243 bp,图1B),说明人工合成DNA接头已连接到pKAFCR1的XbaI-SacI酶切位点。

利用M13-F和M13-R引物对重组质粒pKAFCR1+MCS进行双向测序鉴定,结果表明上述构建连接正确。这样构建形成的pKAFCR1+MCS在35S启动子与NOS终止子之间加入了XbaI、HpaI、PacI、SmaI(XmaI)、StuI、KpnI、XhoI 和SacI多克隆酶切位点MCS(图2)。

2.2 pNULPGE200质粒载体的构建及鉴定

pKAFCR100(13 221 bp)经HindⅢ和StuI双酶切处理后,凝胶电泳分离回收获得已切除HindⅢ-StuI小部分的pKAFCR100(13 206 bp,图3A);pKAFCR1+MCS(3 814 bp)经HindⅢ和PvuⅡ双酶切处理,凝胶电泳分离回收获得包含35SMCS-NOS的片段(1 358 bp,图3B);将回收获得的pKAFCR100与35S-MCS-NOS片段连接后形成的重组质粒pNULPGE200(14 564 bp)转化到大肠杆菌,经菌落PCR鉴定,确认电泳条带正确(1 857 bp、963 bp、611 bp、776 bp,图3C),说明 pKAFCR1+MCS的35S-MCS-NOS片段已插入到pKAFCR100的HindⅢ-StuI酶切位点。

表1 各种PCR引物和DNA接头Table1 Primers and adapters

图1 pKAFCR1质粒酶切以及pKAFCR1+MCS质粒构建后的菌落PCR鉴定Fig.1 Restriction digestion of pKAFCR1 and colony PCR for identification of the constructed pKAFCR1+MCS plasmid

利用 CR100 Hind35S-S、CR100 omega-A 引物对pNULPGE200进行双向测序鉴定,结果表明上述构建连接正确。这样构建形成的pNULPGE200具有35S-MCS-NOS,经PCR等方法克隆得到的目的基因可以多种方式很方便地连接到35S启动子与NOS终止子之间,使目的基因能够在植物体内稳定表达;该质粒载体同时还具有独立表达的卡那霉素NPTⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)耐性基因和sGFP(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,可用于基因转化时的筛选(图4)。

2.3 pNULPGE200在植物基因表达载体构建中的应用

为了验证文中所构建的pNULPGE200的使用效果,以假单胞菌携带质粒的二甲苯单加氧酶编码基因(PpXylM+XylA)片段为材料进行了基因表达载体的构建实验。pNULPGE200(14 564 bp)经PacI和KpnI双酶切(14 544 bp)后,与同样酶切处理的PpXylM+XylA(2 320 bp)片段进行连接,转化大肠杆菌。经菌落PCR鉴定,确认电泳条带正确(2 333 bp、611 bp和776 bp,图5),说明该基因片段已正确连接到pNULPGE200的35S启动子与NOS终止子之间的PacI和KpnI酶切位点上。这样获得的基因表达载体pNULPGE04101(16 865 bp,图6),其目的基因的上游和下游分别连接了启动子和终止子,转化到农杆菌后可用于植物基因转化、目的基因功能研究等。

与pNULPGE200相比,目的基因构建到对照载体pBI121比较麻烦,因为pBI121在目的基因插入的多克隆酶切位点的上下游缺少目的基因独立表达的启动子和终止子。首先,PpXylM+XylA基因片段经PacI和KpnI双酶切后(2 320 bp),与经同样酶切的过渡载体pKAFCR1+MCS(3 793 bp)进行连接,在上下游分别加上35S启动子和NOS终止子。然后,利用PvuⅡ切下含有35S-PpXylM+XylA-NOS的片段(3 769 bp),将该片段与经限制性内切酶SbfI单酶切、DNA平滑化试剂盒处理的pBI121(14 587 bp)连接,构建成对照载体pBI121-PpXylM+XylA(图7)。经双向测序验证,确定pNULPGE04101、pBI121-PpXylM+XylA构建正确。

图3 pKAFCR100和pKAFCR1+MCS质粒酶切以及pNULPGE200质粒构建后的菌落PCR鉴定Fig.3 Restriction digestion of pKAFCR100 and pKAFCR1+MCS and colony PCR for identification of the constructed pNULPGE200 plasmid

图4 pNULPGE200质粒的T-DNA区段及多克隆酶切位点Fig.4 The T-DNA region and the multiple cloning sites of pNULPGE200 plasmid

图5 pNULPGE04101基因表达载体构建后的菌落PCR鉴定Fig.5 Colony PCR for identification of the constructed gene expression vector pNULPGE04101

2.4 pNULPGE200构建的基因表达载体在植物基因转化中的应用

用含有基因表达载体pNULPGE04101以及对照载体pBI121-PpXylM+XylA的农杆菌EHA105对矮牵牛无菌苗的叶片外植体进行基因转化。经侵染、共培养、愈伤组织和不定芽的诱导与筛选后,15 d左右部分叶片切口部位开始膨胀变大,随后生成愈伤组织。30 d后,愈伤组织表面陆续形成芽点,这些芽点逐渐发育成为不定芽。不定芽伸长后,继而进行不定根诱导以生成完整植株。再生植株经基因组PCR鉴定,证实构建到基因表达载体pNULPGE04101以及对照载体pBI121-PpXylM+XylA的T-DNA区段的PpXylM+XylA基因已经导入到矮牵牛转基因植株(图8)。整个分化过程中,在抗生素(卡那霉素)筛选的同时,利用sGFP荧光和GUS染色分别对经农杆菌EHA105/pNULPGE04101以及对照EHA105/pBI121-PpXylM+XylA基因转化后外植体形成的愈伤组织、不定芽和不定根等进行观察分析(图9)。由于经pNULPGE04101转化后分化出的组织细胞活体可以利用荧光显微镜进行判断,特别是在愈伤组织阶段,有荧光的部分切下继续培养,没有荧光的部分淘汰,因此筛选比较有效。而pBI121-PpXylM+XylA转化后分化出的愈伤组织经GUS染色后细胞即失去活性。检测结果显示,pNULPGE04101的基因转化效率(PCR阳性植株/外植体×100%)为29%,明显高于pBI121-PpXylM+XylA的基因转化效率7%。

3 讨论

本研究利用实验室现有的pKAFCR1和pKAFCR100两种质粒[8],经改造构建了一个用于植物基因表达载体构建的质粒载体pNULPGE200。利用该质粒载体构建植物基因表达载体,具有简便和高效等优点。

pNULPGE200质粒因为引入了植物基因表达最常用的35S启动子和NOS终止子,以及之间的多个克隆酶切位点 MCS(HpaI、PacI、SmaI(XmaI)、StuI、KpnI、XhoI 和SacI),克服了目前常用于植物基因表达载体构建的质粒载体(如pBIN19[2]、pBI121[3]、pIG121-Hm[4]、pMSIsGFP[5]和 pCAMBIA 系列[6]等)的一些缺点,包括:目的基因插入的多克隆酶切位点有限;上下游缺少目的基因独立表达的启动子和终止子,需要预先把目的基因克隆到一个过渡载体,连接上35S和NOS后再亚克隆到基因表达载体;操作麻烦等。对于本研究构建的pNULPGE200质粒,利用PCR等方法克隆得到的目的基因片段可直接连接到pNULPGE200的35S启动子与NOS终止子之间,从而构建成为在植物体内能够独立表达的载体。由于pNULPGE200质粒的 MCS 既有粘性末端(PacI、XmaI、KpnI、XhoI和SacI)也有平滑末端(HpaI、SmaI和StuI)酶切位点,目的基因在PCR扩增(或人工合成)时,可以通过正反向引物的5′端(或两端)分别引入这些粘性末端或平滑末端酶切位点,与经同样酶切后的pNULPGE200进行连接;或者利用有些DNA聚合酶(如Phusion高保真DNA聚合酶)在PCR扩增后能够产生平滑末端产物的特点,可以直接与经平滑末端酶切(HpaI、SmaI或StuI中一种)后的pNULPGE200进行连接。

图6 pNULPGE04101基因表达载体的T-DNA区段Fig.6 The T-DNA region of pNULPGE04101 gene expression vector

图7 pBI121-PpXylM+XylA基因表达载体的T-DNA区段Fig.7 The T-DNA region of pBI121-PpXylM+XylA gene expression vector

图8 矮牵牛基因转化植株的PCR分析Fig.8 PCR analysis of transgenic P.hybrid plantlets

图9 矮牵牛基因转化植株的再生及各阶段sGFP和GUS基因表达Fig.9 Regeneration of transgenic P.hybrid plants and monitoring of sGFP and GUS expressions at different developmental stages

另外,pNULPGE200还包含独立表达的卡那霉素NPTⅡ耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因,外植体经农杆菌侵染后的整个分化过程中,可以利用添加有卡那霉素的培养基进行筛选,也可以利用荧光显微镜进行判断和观察,筛选效果比较好。再者,pNULPGE200在目的基因插入的35S启动子和NOS终止子的上游和下游、NPTⅡ抗生素耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因前后均有酶切位点,可以根据实验需要选择更合适的基因元件对其进行更换。

为了验证所构建的pNULPGE200质粒的使用效果,我们以假单胞菌携带质粒的二甲苯单加氧酶编码基因PpXylM+XylA片段为材料,经酶切后直接构建了可用于植物基因转化的表达载体pNULPGE04101。与利用pBI121构建植物基因表达载体需要克隆到一个过渡载体,然后再亚克隆相比,更简单高效。此外,该表达载体pNULPGE-04101经农杆菌介导法转化矮牵牛叶片后,获得了转基因植株,其基因转化效率也明显高于由pBI121构建的基因表达载体。

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