抑制自噬晚期阶段增强榭皮素诱导的胶质瘤细胞凋亡

高丹丹 曹军 徐远志 冯尽意 徐继 周莉 刘定胜 楼美清 毕云科*

(1上海市浦东新区周浦医院肿瘤血液科，上海 201318; 2日照市人民医院神经外科，山东 日照 276826; 3上海交通大学附属第一人民医院神经外科，上海 200080)

胶质瘤是成人中最常见、恶性程度最高的原发性颅内肿瘤[1]，多年来一直是广大神经外科医师的研究热点。虽然采取了包括手术、放化疗在内的综合治疗，但患者预后仍然不容乐观[2]。榭皮素(quercetin, Quer)是一种存在于很多中药中的黄酮类化合物[3]，对很多肿瘤包括胶质瘤具有杀伤作用。Quer及其代谢物能够透过血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)到达中枢神经系统，这是胶质瘤化疗的必要条件[4]。

自噬是依赖于溶酶体的一种代谢过程，与细胞的生存、死亡有很大关系[5-6]。在很多肿瘤中都有自噬的发生，包括胶质瘤，但自噬对肿瘤生存或死亡的影响并不清楚。研究表明，自噬在肿瘤的起始阶段起抑制作用，在肿瘤的发展阶段起促进作用[7]。报道显示榭皮素能够诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的发生，但在胶质瘤方面的研究很少。由于自噬是一多步代谢过程，我们猜测干扰自噬不同阶段会对榭皮素的毒性有不同影响。本研究采用药物及基因敲除的方法分别抑制了自噬的不同阶段，检测了榭皮素作用于胶质瘤细胞系的毒性，并对其机制进行了初步探讨。

材料与方法

一、材料

人源胶质瘤细胞系U87和U251，鼠源胶质瘤细胞系C6均来源于日本理化学研究所(Rikagaku Kenkyusho, RIKEN)细胞库。

二、主要试剂与药品

细胞培养试剂购自美国Gibco公司，转染试剂购自美国Invitrogen公司；Western Blot试剂购自中国碧云天公司；(short hairpin RNA, shRNA)质粒和阴性乱序对照质粒均购于上海吉玛制药技术有限公司。兔源微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated proteins light chain 3, LC3)抗体，兔源Beclin 1抗体和鼠源β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，兔源capase-3抗体购于美国美国Cell Signaling Technology公司，二抗购于美国Bioworld公司。榭皮素、氯喹和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)购自美国Sigma公司。

三、主要实验方法

1.细胞培养：所有细胞均使用改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's modified essential medium, DMEM)高糖培养基、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗在37 ℃的5% CO2细胞孵育箱内培养，选取对数生长期细胞进行实验。细胞长满瓶底80%时进行细胞传代。

2.噻唑蓝比色法(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide assay, MTT)：选取对数期生长的U87和U251细胞，以5 000个/孔种植于96孔板，当细胞融合达70%时给予相应处置。之后每孔加入10 μL MTT，在37 ℃ 孵育4 h，终止培养。弃掉孔内液体，避光条件下加入200 μL二甲基亚砜，放置摇床晃动10 min使结晶物充分溶解。用酶标仪于490 nm波长处测定各孔的吸光度，并记录结果。

3.流式细胞技术：细胞经转染和药物处理后，用胰酶常规消化，计数后取1×106/mL个细胞，2 000 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清。加入1 mL预冷的磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer solution, PBS)，轻轻吹打细胞使之悬浮。再次2 000 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清。将细胞重悬于190 μL磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶 (annexin V-fluorescein isothiocyanate/popidium iodide, Annexin V-FITC/PI)结合液，加入10 μL Annexin V-FITC轻轻混匀，避光4 ℃反应10 min。2 000 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液，加入5 μL PI，300目滤网过滤，即刻流式细胞仪检测。

4.Western Blot：细胞经药物处理后加入蛋白裂解液(radio-immunoprecipitation assay, RIPA)。超声细胞破碎仪处理并离心，收集所有细胞裂解物，通过蛋白定量分析评估蛋白浓度。通过10%～15% 的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)进行分离，将分离的蛋白在恒压120 V的情况下转移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。将PVDF膜浸在5% 的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)中封闭过夜。接着将一抗结合PVDF膜于4 ℃孵育过夜，然后附着相应的二抗室温孵育1 h。按照说明，通过标准增强化学发光法检测标记信号。

5.细胞转染：将细胞消化后接种于6孔板，当细胞融合达到40%～70%时准备转染，每个转染样品制备DNA-Lipofectamine 2 000复合物。因质粒中带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)荧光基团，转染成功后可在荧光显微镜下检测到荧光。

结 果

一、Quer抑制胶质瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡及自噬发生

分别用特定浓度的Quer处理U87及U251细胞系24 h、48 h，MTT检测Quer的毒性。如图1A所示，Quer可以抑制胶质瘤细胞增殖，呈浓度依赖趋势；且药物处理48 h较24 h的毒性作用明显。为了探讨Quer诱导的细胞死亡与凋亡的关系，通过Western Blot检测了凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3的表达。如图1B所示，随着Quer浓度的增加，cleaved Caspase-3的表达也越高。

为了研究Quer能否诱导自噬发生，以及其诱导的凋亡是否与自噬有关，通过透射电镜(transmission electron microscope, TEM)及Western Blot检测细胞的自噬水平。如图1C所示，Quer组的胞浆内可见很多双层膜结构的存在，表明细胞内自噬体的形成，而对照组没有类似发现。接下来，用不同浓度的Quer分别处理细胞系16 h，Western Blot检测LC3-II的表达。如图1D，随着Quer浓度的增加，LC3-II表达逐渐增加。

二、3-MA降低Quer对胶质瘤细胞的毒性作用

3-MA可以通过抑制III型PI3K来抑制早期自噬。为了研究Quer诱导的细胞死亡与自噬的关系，我们观察联合3-MA后Quer对细胞的毒性。首先，MTT检测3-MA对细胞增殖的影响，如图2A，3-MA单药可以抑制胶质瘤细胞的增殖，且该抑制作用呈剂量依赖。随后，我们联用了有效浓度的3-MA(1 mM/L)及Quer(50 μM)，发现联合应用比单药Quer的毒性反而要小(图2B)，即3-MA降低了Quer对细胞的毒性作用。

三、CQ通过阻断晚期自噬增强Quer的毒性作用

为了进一步验证自噬在Quer诱导的细胞凋亡中的作用，我们选用了自噬晚期抑制剂CQ。首先，经MTT检测CQ单药及联合Quer对胶质瘤细胞的毒性。图3A显示，CQ单药对胶质瘤细胞具有较强杀伤作用。5 μM/L为实验组中的最小浓度，对胶质瘤细胞毒性作用较小。然而，当与50 μM/L Quer联合应用时，显著增强了Quer对细胞的毒性作用(图3B)。

接下来，通过Western Blot及流式细胞技术检测细胞凋亡，初步探讨联合用药导致细胞死亡的机制。如前，Quer可以增强cleaved Caspase 3的表达，且呈剂量依赖性，表明Quer单药可以诱导细胞凋亡。Western Blot显示，与单药组相比，联合组cleaved Caspase-3的表达明显增多(图3C)，即CQ联合Quer诱导了更多的细胞凋亡。流式结果进一步验证CQ增强了Quer诱导的细胞凋亡。

TEM结果显示，单独应用50 μM/L Quer或5 μM/L CQ处理细胞时，都能诱导细胞产生大量的自噬体，Quer与CQ联合用药则诱导了更多的自噬体累积(图3E)。累积的自噬体大部分为单层膜结构，这是晚期自噬体的特征。以上结果表明自噬体的大量累积可能是自噬降解过程被CQ阻断所致，而自噬体的大量积累将诱导细胞凋亡。

四、敲除Beclin 1基因对Quer细胞毒性的影响

1.敲除Beclin 1抑制Quer诱导的自噬：鉴于化学性自噬抑制剂的非特异性，我们利用Beclin 1 shRNA敲除了两种细胞系中的自噬关键基因Beclin 1。随后，50 μM/L Quer分别处理转染了shBeclin 1质粒和对照质粒的细胞。结果显示，与vector+Quer组相比，shBeclin 1+Quer组的LC3-II蛋白表达下降明显(图4B、C)。以上结果表明沉默Beclin 1能有效抑制Quer诱导的自噬。

2.敲除Beclin 1减弱Quer和CQ的协同杀伤作用：为了确定Quer和CQ的协同杀伤作用是否依赖于自噬，我们分单药及联合处理了转染对照质粒和shBeclin 1质粒的细胞系。如图4A所示，敲除Beclin 1组的胶质瘤细胞经联合处理后，细胞活性优于转染对照质粒组，这表明Beclin 1联合杀伤中起关键作用。为了进一步验证Beclin 1的关键地位，我们进行Western Blot检测。如图4C所示，相比于转染对照质粒组，敲除Beclin 1组的LC3-II蛋白及Caspase 3蛋白表达明显降低，表明Beclin 1在联合用药中自噬及凋亡的发生至关重要。

图1 Quer对胶质瘤细胞系U87和U251的作用

Fig 1 Effect of Quer treatment on glioma cell lines

A: Cell viability was determined by MTT; B: Effect of Quer on caspase 3 protein level in U87 and U251 cells; C: TEM photomicrographs of U87 and U251 cells (Arrows indicated autophagic vacuoles); D: Total cell lysates were blotted with anti-LC3 antibodies.

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group. Scale bars=2 μm.

图2 Quer联合3-MA对胶质瘤细胞系的作用

Fig 2 Effects of Quer and 3-MA on glioma cell lines

A: Cell viability incubated with different concentrations of 3-MA was measured by MTT; B: U87 and U251 cells were treated with Quer (50 μM), with or without 3-MA (1 mM) for 24 h.

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group.

图3 CQ联合Quer对胶质瘤细胞系的作用

Fig 3 Effects of Quer and CQ on glioma cell lines

A: Cell viability was measured by MTT; B: Cells were treated with Quer (50 μM), with or without CQ (5 μM) for 24 h; C: Total cell lysates were blotted with anti-caspase 3 antibodies; D: Cell death was assessed by flow cytometry; E: TEM photomicrographs of U87 cells (Arrows indicated AVs).

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group. Scale bars=2 μm.

图4 敲除Beclin 1对Quer联合CQ效果的影响

Fig 4 Effect of Beclin 1 knockdown on combination treatment of Quer and CQ

A: Cell viability was evaluated by MTT; B: Effect of Beclin 1 knockdown on Beclin 1 and LC3 protein level expression. Cell lysates were blotted with anti-Beclin 1 and anti-LC3 antibodies; C: Cell lysates were blotted with anti-Beclin 1, anti-LC3, and anti-caspase 3 antibodies.

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group.

讨 论

我们揭示了榭皮素能够抑制胶质瘤细胞系的增殖并诱导凋亡，且促进自噬的发生。凋亡和自噬有着密切的联系：凋亡可以起始于自噬，自噬也通常能诱导凋亡。比如，自噬体的形成是激活凋亡相关蛋白Caspase 3的一个因素[8]。此外，自噬体的大量累积会产生毒性并且激活凋亡[9]。我们假设联用自噬诱导剂与自噬抑制剂导致的凋亡很可能与自噬体的大量累积有关。我们发现当联合3-MA及Quer时，Quer的毒性作用有所减弱，这可能与3-MA抑制了早期自噬，自嗜体不能形成及累积有关；当联合CQ与Quer时，Quer的毒性作用明显增强，这可能与CQ阻断了自嗜体与溶酶体结合，导致大量自嗜体积累有关。简单讲，大量凋亡的发生往往伴随着待降解自噬体的累积，这与我们的假设一致。

Beclin 1是一种自噬关键基因。为了进一步探讨Quer诱导的自噬与凋亡的关系，我们利用shBeclin 1敲除了胶质瘤细胞系中Beclin 1的表达。结果发现单独应用Quer或者联合应用CQ处理细胞后，凋亡明显减少。这表明CQ以依赖Beclin 1的方式增强Quer对胶质瘤细胞的毒性作用。

总之，我们的研究表明，Quer能够诱导胶质瘤细胞凋亡及自噬的发生。并且，抑制自噬的早期阶段减弱了Quer的细胞毒性，而抑制自噬的晚期阶段增强了Quer的细胞毒性。因此，联合应用Quer及自噬晚期抑制剂是胶质瘤治疗的一种新策略。

参考文献

1BECHER O J, HOLLAND E C. Glioma stem-like cells keep their H3.3 variant levels at bay [J]. Cancer Cell, 2015, 28(6): 679-680.

2杨学军. 恶性胶质瘤生物治疗的现状及前景 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2013,12 (4): 289-292.

3VIDAK M, ROZMAN D, KOMEL R. Effects of flavonoids from food and dietary supplements on glial and glioblastoma multiforme cells [J]. Molecules, 2015, 20(10): 19406-19432.

4YANG Y, BAI L, LI X, et al. Transport of active flavonoids, based on Cytotoxicity and lipophilicity: an evaluation using the blood-brain barrier cell and Caco-2 cell models [J]. Toxicol In Vitro, 2014, 28(3): 388-396.

5TANIDA I. Autophagosome formation and molecular mechanism of autophagy [J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 14(11): 2201-2214.

6马文科, 罗鹏, 戴舒惠, 等. 高原低氧环境对小鼠海马神经元自噬的影响及意义 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2017, 16(2): 120-123.

7KATHEDER N S, KHEZRI R, O'FARELL F, et al. Microenvironmental autophagy promotes tumour growth [J]. Nature, 2017, 541(7637): 417-420.

8LI C, LIU Y, LIU H, et al. Impact of autophagy inhibition at different stages on cytotoxic effect of autophagy inducer in glioblastoma cells [J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 35(4): 1303-1316.

9MA X, LIU H, FOYIL S R, et al. Impaired autophagosome clearance contributes to cardiomyocyte death in ischemia/reperfusion injury [J]. Circulation, 2012, 125(25): 3170-3181.