‘桂葡6号’葡萄酒花色苷组分HPLC-MS分析

成 果，黄 羽，杨 莹，谢林君，黄小云，余 欢，谢太理，周咏梅，张 劲*

（广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西 南宁 530007）

花色苷类物质是葡萄果实和葡萄酒的主要呈色物质，在很大程度上决定着葡萄果实和葡萄酒的品质[1]。葡萄的遗传背景是品种花色苷组分的决定因素。因此，花色苷的组成和含量常被用作鉴定不同品种葡萄果实和葡萄酒的‘指纹’[2]。欧亚种（Vitis vinifera）葡萄和葡萄酒仅含有花色素单糖苷[2-3]，而美洲种（V. labrusca）、东亚种群的毛葡萄（V. quinquangularis）和刺葡萄（V. davidii）及其葡萄酒不仅含有花色素单糖苷也含有双糖苷[2,4]。

‘桂葡6号’是经驯化筛选出的丰产、抗病性好的酿造葡萄品种，源于广西地区收集的野生资源，2015年经审定后命名。在南宁地区避雨栽培条件下，‘桂葡6号’第1茬果萌芽期3月上旬至中旬，开花期4月上旬，果实成熟期7月上、中旬，从萌芽至浆果成熟120 d左右；第2茬果萌芽期9月上旬，开花期10月上旬，果实成熟期12月下旬，从萌芽至浆果成熟120 d左右，属中、晚熟品种。该品种抗葡萄黑痘病、霜霉病和白粉病的能力较强，花芽分化优良，丰产性能强。在南方地区，棚、篱架栽培均可，露地和避雨栽培均可，但避雨栽培效果更好。‘桂葡6号’冬果酿酒品质优良，可溶性固形物可达18%以上，果实中酚类物质含量较高[5-6]，是广西当地颇具潜力的酿酒品种。近年来，‘桂葡6号’种苗在广西地区陆续得到推广。今后将在广西葡萄及葡萄酒产业布局中占据重要地位，是实现当地农民脱贫致富、推动地区经济发展的重要农业资源。

‘桂葡6号’酿造的葡萄酒酒体呈宝石红色，澄清透明，果香醇正，酒体平衡，余味绵长。目前，已经对‘桂葡6号’果实发育过程中花色苷成分、含量变化以及相关基因表达规律进行了研究[6]。然而‘桂葡6号’葡萄酒的花色苷组分特征仍不清楚。本研究采用高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）联用技术测定乙醇发酵结束和瓶储3 个月的‘桂葡6号’葡萄酒中花色苷成分及其含量的变化，并与欧亚种葡萄‘赤霞珠’进行对比，进一步完善‘桂葡6号’品质评价体系，为打造具有地方特色的葡萄酒品牌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验地位于广西农业科院葡萄与葡萄酒研究所科研基地（22°50′59′ N，108°14′35′ E）。供试葡萄（Vitis L.）品种为2014年定植的‘桂葡6号’（Vitis sp.）和2007年定植的‘赤霞珠’（Vitis vinifera L.），2 个品种的整形方式分别为一字型和单干双臂型，栽植密度2.5 m×1.5 m，南北行向，一年两收模式下避雨栽培，灌溉方式均为滴灌。2 个葡萄品种冬果达到技术成熟度（糖酸比≥20）时进行人工采收。

二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷标准品 美国Sigma-Aldrich公司；甲醇、甲酸和乙腈（均为色谱级） 美国Fisher公司；Lalvin 71B活性干酵母 法国Lallemand公司。

1.2 仪器与设备

UV-1801紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；5804R低温冷冻离心机 德国Eppendorf公司；R206 1100系列液相色谱-离子阱质谱联用仪（包括G1379A真空溶剂脱气机、G1311A四元高压梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A二极管阵列检测器和Zorbax SB C18柱） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 单品种酿酒实验

于2015年12月16日人工采收葡萄，除梗破碎后入罐，每个品种3 罐（20 L/罐）作为3 次重复。随后每罐按照20 g/t和30 mg/L的剂量加入果胶酶和H2SO3（在葡萄醪中加糖，预设葡萄酒乙醇体积分数为12.5%）。放置在15 ℃恒温冷库中，24 h后按照200 mg/L剂量加入Lalvin 71B活性干酵母。乙醇发酵过程控制在25 ℃直到残糖小于4 g/L。每天进行压帽、测定温度和比重。乙醇发酵结束后取样，测定酒样基本理化指标，包括：乙醇体积分数、残糖（以葡萄糖计）、总酸（以酒石酸计）、挥发酸、单宁、总酚和pH值，检测方法参照《葡萄与葡萄酒实验技术操作规范》[7]，其余样品放－20 ℃保存待测。CIELab法测定酒样色度色调。CIELab参数（L*、a*、b*、C*、H*）利用1 mm光程条件下440、530 nm和600 nm酒样吸光度计算[8]。乙醇发酵结束后每个品种3 次重复酒样分别装瓶放置在15 ℃保存，瓶储3 个月后取样，－20 ℃保存待测。

1.3.2 葡萄酒中花色苷类物质的检测

参照文献[9]方法测定。采用Agilent 1100系列配有二极管阵列检测器的LC/MSD Trap-VL液相色谱-离子阱质谱联用仪进行样品定性定量分析。系统检测包括电喷雾离子源和离子阱质谱检测器。所有部件由安捷伦v.5.2化学工作站控制完成检测。HPLC条件：Zorbax Eclipse SB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：含2%甲酸-6%乙腈溶液，流动相B：含2%甲酸-54%乙腈溶液。洗脱程序：1～18 min，10%～25% B；18～20 min，25% B；20～30 min，25%～40% B；30～35 min，40%～70% B；35～40 min，70%～100% B。流速1.0 mL/min；柱温50 ℃；检测波长525 nm；波长扫描范围200～900 nm；进样量30 μL。MS条件：电喷雾离子源，正离子模式；雾化器压力35 psi；干燥气流速12 L/min；干燥气温度300 ℃；质量扫描范围m/z 100～1 500。每个样品重复进样3 次。

1.3.3 葡萄酒中花色苷类物质的定性与定量

花色苷定性工作对照中国农业大学葡萄酒研究中心建立的“葡萄与葡萄酒花色苷HPLC-UV-MS指纹谱库”完成[9]。建立5～500 mg/L之间、9 个水平、3 个重复的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷标准曲线，相关系数在0.999以上，其他花色苷以相当于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量计。

1.4 数据处理

利用独立样本t检验在P值小于0.05水平下进行显著性分析。利用主成分分析（principal component analysis，PCA）更加直观反映2 个品种酒样花色苷组成及含量差异。PCA和数据处理采用SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago,IL, USA）。聚类分析利用MetaboAnalyst 3.0进行。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒基本化学指标与颜色参数

表1 ‘桂葡6号’和‘赤霞珠’葡萄酒化学指标与CIELab参数Table 1 Chemical indicators and CIELab color parameters of ‘Guipu 6’and Cabernet Sauvignon wines

如表1所示，‘桂葡6号’葡萄酒乙醇体积分数、挥发酸、单宁含量和pH值显著低于‘赤霞珠’，而残糖、可滴定酸和总酚含量显著高于‘赤霞珠’。与乙醇发酵结束‘赤霞珠’酒样相比，‘桂葡6号’葡萄酒红-绿色调值（a*）和色度值（C*）显著增强，亮度值（L*）无显著差异，而黄-蓝色调值（b*）和色调角值（H*）显著减弱。结果表明，‘桂葡6号’葡萄酒的颜色更深、红色色调和蓝色色调更强。

2.2 葡萄酒中花色苷类物质检测

表2 ‘桂葡6号’和‘赤霞珠’乙醇发酵结束和瓶储3 个月葡萄酒中花色苷HPLC-MS的分子离子与碎片离子信息Table 2 Molecular ions and fragment ions of anthocyanins in ‘Guipu 6’and Cabernet Sauvignon wines

续表2

如表2所示，乙醇发酵结束‘桂葡6号’葡萄酒中共检测到25 种花色苷，而‘赤霞珠’葡萄酒中检测到16 种。另外，瓶储3 个月之后的‘桂葡6号’和‘赤霞珠’葡萄酒中的花色苷组成与乙醇发酵结束相比发生变化。‘桂葡6号’葡萄酒中共检测到19 种花色苷，而‘赤霞珠’葡萄酒中检测到17 种。与‘赤霞珠’相比，‘桂葡6号’酒样中未检测到：花翠素-3-O-（6-O-乙酰化）-单糖苷、二甲花翠素-3-O-单糖苷-丙酮酸、花青素-3-O-（6-O-乙酰化）-单糖苷、二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰化）-单糖苷-丙酮酸、二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰化）-单糖苷-乙醛、二甲花翠素-3-O-（6-O-香豆酰化）-单糖苷-丙酮酸、二甲花翠素-3-O-（6-O-咖啡酰化）-单糖苷、甲基花翠素-3-O-（顺式-6-O-香豆酰化）-单糖苷、二甲花翠素-3-O-（反式-6-O-香豆酰化）-单糖苷、二甲花翠素-3-O-单糖苷-4-乙烯基苯酚。由此可见，2 个单品种酒花色苷组成差异明显，与欧亚种‘赤霞珠’相比，野生资源‘桂葡6号’花色苷种类多，但缺乏酰化类花翠素单糖苷及丙酮酸化、乙醛化及乙烯基酚化的吡喃型花色苷。

2 个品种酒样自乙醇发酵结束到瓶储3 个月后，花色苷的组成发生变化。与乙醇发酵结束酒样相比，瓶储3 个月的‘桂葡6号’酒样中未检测到：花青素-3,5-O-双糖苷、花翠素-3-O-（6-O-香豆酰化）-双糖苷、甲基花青素-3-O-（反式-6-O-香豆酰化）-双糖苷、花青素-3-O-（6-O-香豆酰化）-单糖苷和甲基花翠素-3-O-（反式-6-O-香豆酰化）-单糖苷和二甲花翠素-3-O-（6-O-香豆酰化）-单糖苷-乙醛。与乙醇发酵结束酒样相比，瓶储3 个月的‘赤霞珠’酒样中测到更多的吡喃型花色苷。

2.3 葡萄酒中花色苷聚类分析

为更加清晰探究‘桂葡6号’葡萄酒花色苷组分特征，利用乙醇发酵结束和瓶储3 个月酒样中各类花色苷含量进行K-means聚类分析，如图1所示。乙醇发酵结束和瓶储3 个月的‘桂葡6号’酒样中含量最高的花色苷是甲基花青素-3,5-O-双糖苷。与2 个时期‘赤霞珠’酒样的比较结果不同，‘桂葡6号’乙醇发酵结束酒样中的大多数花色苷含量高于瓶储3 个月酒样，其中P27甲基花青素-3-O-（反式-6-O-香豆酰化）-双糖苷、P26甲基花青素-3-O-（反式-6-O-香豆酰化）-双糖苷、P33二甲花翠素-3-O-（顺式-6-O-香豆酰化）-单糖苷、P23甲基花青素-3-O-（顺式-6-O-香豆酰化）-单糖苷、P2花青素-3,5-O-双糖苷、P22花翠素-3-O-（反式-6-O-香豆酰化）-单糖苷含量降低幅度明显。‘桂葡6号’瓶储3 个月酒样中，P1花翠素-3,5-O-双糖苷、P9二甲花翠素-3-O-单糖苷、P17甲基花翠素-3-O-（6-O-乙酰化）-单糖苷含量高于乙醇发酵结束酒样。除P31二甲花翠素-3-O-（6-O-香豆酰化）-单糖苷-乙醛以外，‘赤霞珠’瓶储3 个月酒样中吡喃型花色苷种类和含量较乙醇发酵结束时均增加。

图1 ‘桂葡6号’和‘赤霞珠’葡萄酒中各类花色苷含量聚类分析Fig. 1 Cluster analysis of anthocyanins in ‘Guipu 6’ and Cabernet Sauvignon wines

2.4 葡萄酒中花色苷PCA

图2 ‘桂葡6号’和‘赤霞珠’葡萄酒中花色苷PCAFig. 2 Principal component analysis of total and individual anthocyanins in ‘Guipu 6’ and Cabernet Sauvignon wines

利用乙醇发酵结束和瓶储3 个月‘桂葡6号’和‘赤霞珠’酒样中花色苷总量及各花色苷含量进行PCA，以期更好区分品种间差异。如图2所示，PC1解释了总变量的47.69%，‘桂葡6号’全都位于X轴的正半轴，‘赤霞珠’则位于X轴负半轴。PC1能够将不同时期2 个品种的酒样区分开。PC2解释了总变量的23.64%，瓶储3 个月的‘赤霞珠’和乙醇发酵结束的‘桂葡6号’酒样位于Y轴正半轴，而瓶储3 个月的‘桂葡6号’和乙醇发酵结束的‘赤霞珠’酒样位于Y轴负半轴。‘桂葡6号’2 个时期酒样花色苷组分和含量间的差异小于‘赤霞珠’。

表3 不同酒样中各修饰类型花色苷所占总量比例及花色苷总量Table 3 Proportions of different modified anthocyanins and total anthocyanin contents in different wine samples

如表3所示，‘桂葡6号’酒样中花色苷总量显著高于同期‘赤霞珠’。‘赤霞珠’酒样中仅检测到单糖苷，瓶储3 个月‘桂葡6号’酒样中双糖苷比例增加单糖苷比例显著降低。瓶储3 个月‘桂葡6号’酒样中3’,5’-羟基取代花色苷比例较乙醇发酵结束时增加，而‘赤霞珠’瓶储3 个月后该类花色苷比例则显著降低。另外，‘赤霞珠’酒样中乙酰化、香豆酰化、甲基化和吡喃型花色苷比例显著高于同期‘桂葡6号’。与乙醇发酵结束酒样相比，瓶储3 个月‘桂葡6号’中香豆酰化、甲基化和吡喃型花色苷比例降低。

3 讨论与结论

不同种、相同种的不同品种葡萄酒之间花色苷的种类及含量差异很大[10-11]，相同品种葡萄酒的花色苷组分受到年份、产区、酿造工艺等因素的影响[12-15]。张军翔等[10]建立了9 个不同酿造品种葡萄酒的花色苷HPLC指纹图谱数据库，使不同种/品种能够很好地区分。González-Neves等[16]研究‘丹娜’、‘赤霞珠’和‘美乐’3 个品种葡萄酒花色苷组分差异，结果发现葡萄酒中花色苷的组成与葡萄果实类似，且受到年份影响。二甲花翠素-3,5-O-双糖苷是山葡萄花色苷的主要成分，有无花色素双糖苷是欧亚种葡萄和其他葡萄之间最重要的区别之一[11]。圆叶葡萄（V. rotundifolia）仅含有5 种花色素的双糖苷[17]。Li Jinchen等[18]对山欧杂种‘北冰红’葡萄酒酚类物质组成特点的研究结果表明，二甲花翠素-3,5-O-双糖苷是含量最高的一类花色苷。本研究中，利用酒样中不同类型花色苷组成及含量能够很好地区分2 个品种，这说明‘桂葡6号’酒样花色苷组成与欧亚种‘赤霞珠’差异较大。‘桂葡6号’乙醇发酵结束和瓶储3 个月酒样中双糖苷比例大于50%，含量最高的花色苷是甲基花青素-3,5-O-双糖苷，这说明双糖苷是该品种主要的花色苷类型，与葡萄果实中的研究结果一致[6]。

葡萄酒的花色苷含量取决于葡萄浆果中的花色苷含量和酿造工艺。与此同时，花色苷在发酵过程中会被葡萄皮渣吸附随之和酒石酸盐而沉淀。葡萄酒中花色苷含量的降低主要因为氧化和水解[15]。双糖苷比同类型的单糖苷稳定，但颜色浅[19]。本研究中，‘桂葡6号’酒样中花色苷总量显著高于‘赤霞珠’，符合我国野生葡萄资源花色苷含量普遍高于欧亚种酿酒品种的特征[20]。2 个品种乙醇发酵结束酒样花色苷含量均高于瓶储3 个月，但‘赤霞珠’的降低幅度大于‘桂葡6号’，这与‘桂葡6号’中含有较多的花色素双糖苷有关。

王宏等[8]的研究结果表明，花色苷是影响葡萄酒颜色最重要的因素之一，花色苷总量与色度值（C*）及红-绿色调值（a*）呈正相关关系。本研究中，与乙醇发酵结束‘赤霞珠’酒样相比，‘桂葡6号’葡萄酒红-绿色调值（a*）和色度值（C*）显著增加，这与其花色苷总量较高有关。‘桂葡6号’葡萄酒色调角值（H*）显著低于同期‘赤霞珠’，这与其他研究结果中红-绿色调值（a*）与色调角值（H*）存在的负相关关系结果一致[8]。

在酸性条件下，花色苷的颜色在很大程度上取决于B环上的取代基，羟基增加导致颜色变红，甲氧基增加导致颜色变紫，稳定性增加[21]。3’,5’-羟基取代花色苷包括：花翠素、甲基花翠素、二甲花翠素以及它们的衍生物；3’-羟基取代花色苷包括：花青素、甲基花青素以及他们的衍生物[22]。类黄酮结构骨架中B环经过甲基化取代会降低酚羟基的化学活性，在结构上更加稳定，甲基化花色苷主要包括：甲基花青素、甲基花翠素和二甲花翠素[23]。本研究中，乙醇发酵结束‘桂葡6号’酒样中3′,5′-羟基取代花色苷比例显著低于‘赤霞珠’，而瓶储3 个月之后该类花色苷比例显著高于‘赤霞珠’，这对于‘桂葡6号’葡萄酒颜色的稳定起到积极作用。另外，瓶储3 个月2 个品种酒样甲基化花色苷比例均低于乙醇发酵结束，这说明在瓶储过程中葡萄酒紫色色调变弱，花色苷稳定性降低。花色苷的酰化方式主要分为乙酰化和肉桂酰化（包括香豆酰化和咖啡酰化），花色苷经酰基化修饰可增加其在酸性和中性条件下的稳定性[9]。与‘赤霞珠’相比，‘桂葡6号’葡萄酒中缺乏5 种酰化类的单糖苷，且‘桂葡6号’酒样中的酰基化花色苷比例显著低于‘赤霞珠’。这与‘桂葡6号’果实中酰基化花色苷的比例较低有关[6]。有报道指出，通过控制产量，调节成熟期果实的曝光程度能够改变葡萄及葡萄酒中酰化花色苷与不同程度酰化花色苷的比例[24-26]。因此，通过栽培手段改变‘桂葡6号’果皮中酰化花色苷比例，对于研究葡萄酒颜色的稳定性提升具有重要意义。

吡喃花色苷是葡萄酒中重要呈色物质中的一种新型花色苷衍生物，它的基本结构是在原花色苷结构的基础上，在花色苷的C4位与C5位的羟基之间经环加合反应形成另外的第4个吡喃环[27-28]。葡萄酒发酵过程中检测到的吡喃型花色苷一般是由花色苷单体与丙酮酸（属于Vitisin A类吡喃花色苷）、乙醛（属于Vitisin B类吡喃花色苷）、乙烯基苯酚（属于Vitisin C类吡喃花色苷）和乙烯基-黄烷醇反应生成[29]。与单体花色苷相比，吡喃型花色苷能够更好适应pH值变化和抵御亚硫酸盐的褪色效应[29]。与‘赤霞珠’相比，‘桂葡6号’葡萄酒中缺乏5 种吡喃型花色苷，且‘桂葡6号’酒样中的吡喃型花色苷比例显著低于‘赤霞珠’。这是由于‘桂葡6号’果实中双糖苷比例较高，C4和C5位无法进行成环加合反应。

葡萄酒中的衍生色素（吡喃型花色苷、羟苯基吡喃型花色苷和花色苷-黄烷醇二聚体）对外界环境不如非衍生色素（直接从葡萄果实中提取的花色苷）那么敏感，所以它们对陈年的欧亚种葡萄酒色素稳定性起着关键作用，而双糖苷在葡萄酒中更容易发生褐变[30-31]。因此，今后研究添加不同类型的辅色剂对双糖苷花色苷含量高而衍生色素含量低的‘桂葡6号’葡萄酒的色素稳定性和陈年潜力的影响，对提升广西葡萄酒品质具有重要意义。

‘桂葡6号’乙醇发酵结束和瓶储3 个月酒样中分别检测到25 种和19 种花色苷，双糖苷是其中最主要的花色苷类型，含量最高的是甲基花青素-3,5-O-双葡萄糖苷。与欧亚种‘赤霞珠’相比，瓶储3 个月‘桂葡6号’酒样中3’,5’-羟基取代花色苷比例较高，而酰基化、甲基化和吡喃型花色苷比例较低。‘桂葡6号’花色苷组成与欧亚种‘赤霞珠’差异明显，这由其品种特性决定。‘桂葡6号’葡萄酒体色深，红色和蓝色色调强，酚类物质含量高，是广西地区颇具发展潜力的特色酿酒品种之一。

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