蛋白质半胱氨酸棕榈酰化在食管肿瘤免疫中的作用

申刘青，郭静宜，张秀森，孙玲云，丁晓宁，石林林，张顶彧，原 翔,2，高社干,2

食管癌是我国的高发恶性肿瘤，也是胃肠道最具侵袭性的癌症之一，预后较差，在我国男性新发恶性肿瘤中排名第三、女性新发恶性肿瘤中排第五位，发病率和病死率分居第六和第四位。但食管癌的发病机制尚不清楚。

蛋白质具有生物活性之前要经过基因转录、加工、翻译、修饰等多个复杂过程，其中脂质化修饰是一种重要的翻译后修饰方式，目前已知有5种脂质共价修饰方式，有100多种蛋白质可以发生棕榈酰化修饰，赋予蛋白质极其复杂的生理功能。

脂质修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，脂蛋白对磷脂双分子层具有更高的亲和力，从而对蛋白质在细胞内的定位、转运以及蛋白质间的相互作用和稳定性等产生重要影响。蛋白质脂化存在多种方式，常见的蛋白质都可通过脂肪酸发生棕榈酰化，结合在蛋白质的半胱氨酸、甘氨酸或赖氨酸等残基上。棕榈酰基又可以通过硫酯键结合在蛋白质内部的半胱氨酸上，这个过程被称为S-棕榈酰化。S-棕榈酰化是最常见的蛋白质脂化修饰。

蛋白质的S型棕榈酰化修饰是指饱和的16个碳的棕榈酸盐通过硫酯键共价修饰到蛋白质半胱氨酸的巯基上，这是一种动态、可逆的翻译后修饰方式，可在时间和空间上调节蛋白质的功能。许多棕榈酰化修饰的可溶性或整合膜蛋白质，如信号蛋白质、细胞黏附分子和神经递质受体等，都可调控蛋白质的活性。蛋白—蛋白之间的相互作用，可促进蛋白质的膜定位，从而在细胞信号转导、代谢、凋亡以及疾病的发生发展和癌变中发挥重要的作用。深入研究和理解蛋白质棕榈酰化修饰的机制，通过半胱氨酸定性和定量分析来研究含棕榈酰化修饰的蛋白质，对理解复杂信号通路的空间和时间调节等都具有重要意义。蛋白质棕榈酰化修饰与肿瘤发生发展密切相关，有学者发现棕榈酰化修饰可以激活黑皮质素受体MC1R(melanocortin-1 receptor)，调控黑色素生成，从而抑制黑色素瘤的发生。也有研究发现棕榈酰化修饰能够显著抑制肿瘤细胞PD-L1(programmed cell death protein 1)的降解，从而抑制T细胞对肿瘤的杀伤作用。

本文主要从肿瘤免疫学的角度对S-棕榈酰化的作用进行阐述，包括S-棕榈酰化对蛋白质的作用、吞噬作用的调节、细胞因子受体介导的信号调节、凋亡信号的调控等几个方面，对S-棕榈酰化可能有助于治疗自身免疫性疾病的作用进行了展望。

1 S-棕榈酰化对蛋白质的作用

S-棕榈酰化对于不同的蛋白质有不同的作用，例如影响蛋白质—蛋白质的相互作用、影响蛋白质稳定性等，但其中最常见和最直接的影响是会增加蛋白质的膜结合[1]，这对于外周膜蛋白尤其重要，如Ras亚家族蛋白，它是作为可溶性蛋白而产生的，但Ras蛋白需要在质膜上才能发挥作用。据报道，棕榈酰化—去棕榈酰化的循环可以维持H-Ras和N-ras的亚细胞分布模式[2]。去棕榈酰化将法尼基化相关的Ras，并重新分布在所有细胞膜上，随后在高尔基体上进行棕榈酰化并捕获Ras，再通过分泌途径将其引导至PM(plasma membrane)。这种连续的循环阻止了Ras在内膜上的非特异性停留，从而维持了细胞内部的特异性分布。

对于整体膜蛋白，不需要棕榈酰化来增强膜的靶向作用，但是，许多完整的膜蛋白是需要被棕榈酰化的。在许多报道中，棕榈酰化可以被靶向脂筏，并通过S-棕榈酰化来强化该作用。换句话说，棕榈酰化可以促进整合膜和外周膜蛋白在膜上的缩合。这样的凝聚相可以将相关因素集中在一个小的空间内，从而使生化反应变得更加有效。因此，形成脂筏或将蛋白质靶向脂筏对于发生在细胞膜上的各种细胞信号至关重要。

促进膜结合和脂筏的形成可能与S-棕榈酰化的其他作用有关，如调节蛋白—蛋白相互作用以及蛋白稳定性。例如，以细胞膜上的可溶性蛋白为目标，可能会增加其与膜相关蛋白的相互作用。同样，如果两个完整的膜蛋白都指向同一脂筏，它们的相互作用也会增加；如果相互作用的分子之间可以调控棕榈酰化蛋白的泛素化或溶酶体靶向作用，那么棕榈酰化也可以改变蛋白质的稳定性。

考虑到S-棕榈酰化在促进膜结合和脂筏形成中的作用，猜想可能有许多信号转导都是由棕榈酰化调节的，因此推断棕榈酰化也可以调节细胞膜上的信号转导。

2 吞噬作用的调节

免疫细胞的吞噬作用，是将吞噬的病原体或外来颗粒转运到溶酶体进行降解。吞噬作用需要识别不同的病原体或损伤相关模式分子的表面受体，这些受体包括免疫球蛋白γFc区受体FCGRs(immunoglobulin gamma Fc region receptor)、补体受体以及清除受体(CD36)[3]。这些受体颗粒的识别通常导致Src激酶的激活。在许多下游信号通路中，其中一个通路是通过激活Rac GTP酶来控制肌动蛋白聚合，从而促进吞噬[3]。

一种吞噬作用受体FCGR2A(immunoglobulin gamma Fc region receptor 2A)，可以受棕榈酰化调节，从而促进其脂筏定位[4]。正如在T细胞信号学中所讨论的，一些Src激酶是由棕榈酰化调节的，由于其中一些激酶可以参与吞噬作用，因此它们的棕榈酰化也可以调节吞噬作用。据报道，Arf蛋白ASAP2(Arf-GAP with SH3 domain,ANK repeat,and PH domain-containing protein 2)可在FCGR2A介导的吞噬作用中起重要作用。ASAP2以SELK(selenoprotein K)依赖的方式在Cys86上棕榈酰化，而SELK可以结合ZDHHC6(zinc fifinger DHHC (aspartate-histidine-histidine-cysteine)-type palmitoyltransferases6)，从而促进蛋白质棕榈酰化。因此，ASAP2很可能被ZDHHC6棕榈酰化，ASAP2的棕榈酰化可以促进FCGR(Fc region receptors)介导的吞噬作用[5]。CD36是一种清道夫受体，在免疫、代谢和其他生理过程中具有重要的功能意义[6]。它能识别特定的氧化磷脂、脂蛋白和游离脂肪酸，并介导这些脂质的吞噬作用和信号转导过程。CD36受一个复杂的棕榈酰化—去棕榈酰化循环调节[7]。CD36在高尔基体中被ZDHHC4棕榈酰化，并促进其转运出质膜[8]。在质膜上，ZDHHC5也可以使其保持棕榈酰化状态。然而，CD36可以与脂肪酸结合，激活LYN信号通路，并在Y91上磷酸化，从而抑制其活性。这使得APT1(acyl protein thioesterase1)去棕榈酰化CD36，并促进其内部化和脂肪酸转运到脂滴。之后，CD36被重新棕榈酰化并返回到质膜，再进行下一个循环。阻断棕榈酰化或去棕榈酰化，会抑制脂肪酸的摄取。ZDHHC4的整体敲除或脂肪特异性ZDHHC5的敲除都会降低脂肪酸的摄取，并在冷暴露时出现体温过低的情况。 棕榈酰化循环是否会影响CD36的信号转导或促炎症功能，将是未来研究的一项热点。

CD36棕榈酰化也由硒蛋白SELK调节，它是ZDHHC6的分子伴侣[9]。CD36的棕榈酰化和膜定位可以在非酒精性脂肪性肝炎中增加，CD36的棕榈酰化抑制不仅可以促进细胞内脂质的沉积，也可以通过抑制JNK(junamino-terminal kinases)信号通路从而抑制炎症反应[10]。事实上，CD36能转运脂肪酸，产生促炎症信号，被脂肪酸修饰，同时提供可修饰其他蛋白质的脂肪酸，这一事实表明了脂代谢和炎症之间的复杂关系。

3 细胞因子受体介导的信号调节

细胞因子，如干扰素和白介素，都在肿瘤免疫信号转导中起着重要作用。棕榈酰化可调节多种细胞因子介导的信号通路。细胞因子IL-6(interleukin 6)可以在炎症和免疫调节中发挥着重要作用[11]，它在许多不同类型的细胞，如肝细胞和CD4T细胞中都起重要作用，CD4细胞对Th17细胞的分化也起着重要作用。IL-6通过IL6R和Gp130(基因名为IL6ST，interleukin 6 receptor subunit beta)这两种蛋白质发出信号，并通过JAK2(Janus kinase2)激活STAT3(signal transducer and activator of transcription3)。近年来，有研究表明，IL-6信号通路中的一些蛋白质受棕榈酰化的调控。据报道，IL6ST在背根神经节的轴突中可以被棕榈酰化，但棕榈酰化的位点还尚未确定，目前已知敲除ZDHHC5和ZDHHC8会影响IL6ST定位和下游STAT3磷酸化[12]。

STAT3本身就受棕榈酰化—去棕榈酰化循环调节[13]。ZDHHC7和ZDHHC3可以在Cys108位点上对STAT3进行棕榈酰化，并在IL6ST和JAK2定位的位置发生质膜定位，从而促进STAT3磷酸化。磷酸化的STAT3又可以被APT2去棕榈酰化，从而使磷酸化STAT3转移到细胞核以诱导基因，这对于Th17细胞的分化非常重要。因此，总的来说，棕榈酰化—去棕榈酰化循环可以促进STAT3活化和Th17细胞分化。Th17细胞参与多种自身免疫性疾病，包括炎症性肠病，阻断棕榈酰化(通过敲除ZDHHC7)或去棕榈酰化(通过抑制APT2)将抑制STAT3活化并保护结肠炎模型小鼠。这项研究强调了靶向棕榈酰化对于自身免疫疾病治疗的潜力。

Ⅰ型干扰素信号也可以通过棕榈酰化来调节。Ⅰ型干扰素α和β，是由IFNAR1和IFNAR2(interferon alpha/beta receptor 1/2)发出信号组成的异二聚体受体。干扰素结合触发相关的JAK(Janus kinase)、TYK2(tyrosine kinase 2)和JAK1，从而磷酸化STAT1和STAT2；磷酸化的STAT1和STAT2随后转移到细胞核，促进其靶基因的转录[14]，而IFNAR1和IFNAR2都可被棕榈酰化。经鉴定，IFNAR1棕榈酰化位点为Cys463，这种棕榈酰化将影响STAT1和STAT2的激活。然而，由于IFNAR1的定位似乎不受Cys463棕榈酰化的影响，所以，其确切机制尚不清楚[15]。STAT3、STAT1对IFNAR1和IFNAR2信号转导非常重要，并且也可以被棕榈酰化，但其相关酶尚不清楚。因此，在S-棕榈酰化的调节方面，干扰素信号与IL-6信号有许多相似之处，但仍有待研究。

4 凋亡信号的调控

免疫系统需要细胞凋亡的存在，因为它对于维持细胞自我耐受和杀死感染的细胞非常重要。肿瘤坏死因子受体TNFR(tumor necrosis factor receptor)超家族中的许多死亡受体，如FAS(FS-7 cell-associated surface antigen)(其他名称：CD95/TNFRSF6)和TNFR1等，都可以在细胞表面发挥作用，通过招募FAS相关死亡域蛋白FADD(Fas-associated death domain protein)，和前半胱天冬酶8上游配体结合，在细胞表面发挥功能并启动凋亡。这导致前半胱天冬酶8的断裂和半胱天冬酶级联的启动，这是细胞凋亡的一个决定性特征[16]。

FAS可以在Cys199(小鼠FAS的Cys194)上发生棕榈酰化，棕榈酰化对其脂筏定位和诱导细胞死亡功能非常重要[17]。FAS棕榈酰化由ZDHHC7催化[18]，同样的研究也表明棕榈酰化通过抑制FAS的溶酶体降解来促进FAS的表达。棕榈酰化缺陷小鼠FAS C194V突变体在诱导原代小鼠T细胞、B细胞和树突状细胞凋亡方面存在缺陷，但仍能增强初代T细胞的分化能力，这一过程凸显了棕榈酰化对FAS功能在不同方面的不同影响[19]。

据报道，其他死亡受体也受S-棕榈酰化的调控。DR4 (death receptor 4)(TNFRSF10A)棕榈酰化是脂筏定位和转导TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)诱导死亡信号的能力所必需的[20]。死亡受体6 (DR6/TNFRSF21)也可以被棕榈酰化。最近，有报道称TNFR1可能在Cys248位点发生棕榈酰化，而C248突变会干扰TNFR1在质膜上的定位。TNFR1棕榈酰化是动态的，由配体结合调节。APT2参与TNFR1的去棕榈酰化和TNF诱导的信号转导[21]。

死亡受体的配体同样受到棕榈酰化的调节。FASL可以在Cys82上发生棕榈酰化，棕榈酰化将促进FASL靶向脂筏，并诱导其死亡[22]。TNF在Cys47上可以被棕榈酰化，因此棕榈酰化被认为可以调节TNF脂筏定位和信号转导，但棕榈酰化的其他影响还尚未完全了解，有待进一步研究。FAS下游信号通路也可能受棕榈酰化调控。据报道，ZDHHC17在神经元中可以使半胱天冬酶6棕榈酰化[23]，棕榈酰化抑制半胱天冬酶6的激活，这和其他大多数情况下棕榈酰化促进信号功能是不同的。在T细胞中，FAS信号导致LCK棕榈酰化快速增加，然后减少。这个动态棕榈酰化事件是由PLCG1(1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-1)调控的。在Jurkat T细胞中，内源性ZDHHC21的下调显著抑制了LCK(lymphocyte cell-specifific protein-tyrosine kinase)、ZAP70(70 kDa zeta-chain associated protein)、LAT(linker for activation of T cells)和PLCG1的磷酸化和FAS介导的磷酸化[24]。

细胞凋亡也可通过内在途径启动，主要由BCL-2相关X蛋白(BAX;B-cell lymphoma 2-associated X)，通过线粒体外膜的通透性和细胞色素c同时释放到细胞质中。BAX也可以在Cys126上棕榈酰化，棕榈酰化又可以促进其线粒体定位和凋亡诱导[25]。过表达几种ZDHHC，包括ZDHHC3、7、11和12，可增加BAX棕榈酰化和凋亡。这种棕榈酰化的Cys126残基(以及Cys62)可以被鞘脂代谢的副产物- 2-反十六烯醛进行化学修饰。这种化学修饰也可以增强BAX的凋亡功能[26]。

5 棕榈酰化对食管肿瘤免疫的调控

结直肠癌细胞中的IFNGR1可被棕榈酰化，这允许其与AP3D1(adaptor related protein complex 3 subunit delta 1)相互作用，并促进IFNGR1溶酶体分类和降解。因此，我们推测IFNGR1棕榈酰化也可促进食管癌细胞中IFNGR1的降解和不稳定性[27]。

鉴于IFNGR1棕榈酰化对其与AP3D1的相互作用，以及随后IFNGR1的溶酶体分选和降解在结直肠癌中至关重要，因此，抑制IFNGR1的棕榈酰化可以恢复癌细胞IFNγ信号的完整性，并使食管癌细胞对免疫疗法更加敏感[27]。靶向IFNGR1稳定性，包括棕榈酰化，可能是食管癌患者内在肿瘤免疫治疗中的一种有效的方法。

6 总结

综上，S-棕榈酰化参与了食管肿瘤免疫途径和过程，类似于磷酸化和泛素化。除了广泛的丰度外，棕榈酰化还有一些特点：①尽管有大量的蛋白质被棕榈酰化修饰和调控，但迄今为止已知的棕榈酰转移酶只有23种；②棕榈酰化的主要已知功能可以概括为促进胞质蛋白的膜联结或将膜蛋白靶向到特定的膜域或脂筏上；除此之外，S-棕榈酰化还有其他功能，如调节蛋白质的稳定性和活性等；③棕榈酰化通常可以促进蛋白的修饰功能，促进免疫信号反应，这使得棕榈酰化成为治疗食管癌的一个有前途的靶点。促进棕榈酰化可能有助于对抗感染，而抑制棕榈酰化可能有助于治疗自身免疫性疾病。