根痛平片微生物限度检查方法研究

姬 俊 ，牛萌萌 ，刘彩娜 ，王立云

（1．山东省青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266073； 2．山东省医学科学院 山东省眼科研究所 青岛眼科医院，山东 青岛 266071）

根痛平片是由伸筋草、白芍、烫狗脊、续断、地黄、红花、醋乳香、醋没药、桃仁、牛膝、葛根、甘草制成的中成药，方中白芍、红花、桃仁、乳香、没药为君药[1]，功能主治活血、通络、止痛，用于风寒阻络所致颈椎病，症见肩颈疼痛、活动受限、上肢麻木等[2]。目前，全国有4家药品生产企业有批准文号。根据2015年版《中国药典(四部)》通则1105和1106的非无菌产品微生物限度检查的相关方法[3]，本研究中对3家企业的根痛平片进行了微生物限度方法适用性试验，建立了适用于该产品的微生物限度检查方法。现报道如下。

1 仪器与材料

1．1 仪器

INE500型电热恒温培养箱（德国美墨尔特公司）；H·SWX-600BS型电热恒温水温箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；SHP-160E型生化培养箱（上海三发科学仪器有限公司）；PYX-DHS-40×50型隔水式培养箱（上海跃进医疗器械厂）；TD型电子天平（浙江省余姚市金诺天平仪器有限公司）。

1．2 材料

培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（批号为3105660），胰酪大豆胨液体培养基（批号为3105589），沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号为3104045），沙氏葡萄糖液体培养基（批号为 3104833），麦康凯琼脂培养基（批号为3303011），麦康凯液体培养基（批号为 3104618），肠道增菌液体培养基（批号为3104849），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号为3104750），RV沙门增菌液体培养基（批号为3104847），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号为3104652），均由广东环凯微生物科技有限公司提供，均符合2015年版《中国药典》培养基适用性检查的规定。

菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、枯 草 芽 孢 杆 菌 （Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]、白色念珠菌（Candida albicans） [CMCC（F） 98 001]、 黑 曲 霉 （Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]、 大 肠 埃 希 菌 （Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]、乙 型 副 伤 寒 沙 门 菌 （Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50 094]为传代不超过 5 代的菌种，均由中国食品药品检定研究院提供。

试药：根痛平片（承德燕峰药业有限责任公司＜ A 厂 ＞，规格为每片 0．3 g，批号分别为 16914014，16914024，16914025；海口市制药厂有限公司 ＜B厂＞，规 格 为 每 片 0．3 g， 批 号 分 别 为 160701， 160803，161201；北京斯利安药业有限公司＜C厂＞，规格为每片0．5 g，批号分别为 GP170302，GP170303）。卵磷脂（青岛高科园海博生物技术有限公司，批号为20170302）；聚山梨酯80（天津市富宇精细化工有限公司，批号为20151014）。

2 方法与结果

2．1 菌液制备

按2015年版《中国药典（四部）》通则1105，1106要求制备：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌接种于胰酪大豆胨液体培养基，于30～35℃培养24 h；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养3 d；将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养7 d。取上述金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用0．9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取上述黑曲霉的新鲜培养物加入 5 mL含 0．05%聚山梨酯 80的0．9%无菌氯化钠溶液，洗脱孢子，将菌悬液吸至无菌试管中，用含0．05%聚山梨酯80的0．9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。

2．2 供试液制备

取供试品10 g，以胰酪大豆胨液体培养基为稀释液，加稀释液制成1∶10供试液（不含中和剂），取此1∶10供试液（不含中和剂）用胰酪大豆胨液体培养基梯度稀释制成 1∶100，1∶1 000供试液 1（不含中和剂）。取供试品10 g，以含3%聚山梨酯80和0．3%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基（以下简称含中和剂的稀释液）为稀释液，加此含中和剂的稀释液制成1∶10供试液（含中和剂），取此1∶10供试液（含中和剂）用含中和剂的稀释液梯度稀释制成1∶100，1∶1 000供试液2（含中和剂）。

2．3 计数方法适用性试验

试验组：采用平皿法，取2．2项下供试液1，2各9．9 mL分别置于无菌试管中，在试管中分别加入2．1项下金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液各0．1 mL，混匀，使每1 mL供试液中含菌量≤100 cfu，取上述含有菌液的供试液1 mL注入平皿中，立即倾注15～20 mL熔化的琼脂培养基（温度不超过45℃）。菌液对照组：取胰酪大豆胨液体培养基替代供试液，按试验组操作加入试验菌进行试验。供试品对照组：取相应的供试液，用相应稀释液代替菌液，照试验组方法进行试验。中和剂对照组：取相应的含中和剂的稀释液代替供试品，照试验组方法进行试验。各组平行制备2个平皿，用于需氧菌计数的平皿使用胰酪大豆胨琼脂培养基，于30～35℃培养；用于霉菌和酵母菌计数的平皿使用沙氏葡萄糖琼脂培养基，于20～25℃培养。

2．4 计算

供试品试验组的回收结果＝（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）／菌液对照组的平均菌落数；稀释剂对照组的回收结果＝稀释剂对照组的平均菌落数／菌液对照组的平均菌落数。结果见表1至表2。可见，中和剂能降低根痛平片对枯草芽孢杆菌的抑菌作用，使所选的3家企业的8批样品稀释到1∶100时对枯草芽孢杆菌的回收结果均为0．5～2，符合药典要求。由表2可知，稀释剂对照组回收结果为0．5～2，分别对3家企业的药品进行计数方法适用性试验，结果都符合药典要求。可用含中和剂的胰酪大豆胨液体培养基制备供试液，取1∶100供试液（含中和剂）按照平皿法进行根痛平片的微生物限度的计数检查。

2．5 控制菌检查方法适用性试验

2．5．1 大肠埃希菌

试验组：取2．2项下1∶10供试液（不含中和剂）10mL和菌量≤100 cfu的大肠埃希菌接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中。阳性对照试验组：取菌量≤100 cfu的大肠埃希菌接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中。供试品对照组：取 2．2项下1∶10供试液（不含中和剂）10 mL至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中。阴性对照试验组：取胰酪大豆胨液体培养基10 mL接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中。以上各组于30～35℃培养24 h后，分别取上述各组培养物1 mL接种于麦康凯液体培养基中，42～44℃培养48 h。将其培养物分别划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养 72 h。

表1 根痛平片对枯草芽孢杆菌的计数方法适用性试验结果

表2 根痛平片微生物计数方法适用性试验结果

2．5．2 耐胆盐革兰阴性菌

预培养：取 2．2项下 1∶10，1∶100，1∶1 000 供试液（不含中和剂）10 mL置于无菌试管中，于20～25℃培养 2 h。试验组：分别取以上 1 ∶10，1 ∶100，1 ∶1 000 供试液1 mL和菌量≤100 cfu的大肠埃希菌接种或铜绿假单胞菌至10 mL肠道增菌液体培养基中。阳性对照试验组：取菌量≤100 cfu的大肠埃希菌或铜绿假单胞菌接种至10 mL肠道增菌液体培养基中。供试品对照组：分别取以上 1∶10，1∶100，1∶1 000供试液 1 mL 至 10 mL肠道增菌液体培养基中。阴性对照试验组：取胰酪大豆胨液体培养基1 mL接种至10 mL肠道增菌液体培养基中。以上各组于30～35℃培养48 h后，将上述各组培养物接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24 h。

2．5．3 沙门菌

试验组：取供试品10 g和菌量≤100 cfu的沙门菌接种至200 mL胰酪大豆胨液体培养基中。阳性对照试验组：取菌量≤100 cfu的沙门菌接种至200 mL胰酪大豆胨液体培养基中。供试品对照组：取供试品10 g至200 mL胰酪大豆胨液体培养基中。阴性对照试验组：200 mL胰酪大豆胨液体培养基。以上各组于30～35℃培养24 h后，分别取上述各组培养物0．1 mL接种于RV沙门增菌液体培养基中，30～35℃培养24 h。将其培养物分别划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养48 h。结果见表3。可见，试验组检出阳性菌，供试品对照组和阴性对照试验组均为阴性。因此，可按以上控制菌的检查方法对大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌进行检验。

表3 控制菌检查方法适用性试验结果

3 讨论

根痛平片由12味中药制成，除部分白芍粉碎成细粉直接混合制粒，其他中药均经水煎煮。研究表明，白芍、红花、伸筋草、狗脊、乳香、牛膝的水提物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等有不同程度的抑制作用[4-9]。预试验结果显示，根痛平片对药典中用于方法适用性试验要求的枯草芽孢杆菌的抑制作用明显强于其余4种菌。因此，首先筛选出能消除根痛平片对枯草芽孢杆菌的方法，进而确定根痛平片的菌落计数方法。

考察常规平皿法时，采用不同稀释条件，对枯草芽孢杆菌进行回收试验。结果只有北京斯利安药业有限公司的供试品在1∶50稀释级能使回收符合要求，其他2家的供试品在1∶100稀释级的回收结果均小于0．5。聚山梨酯80和卵磷脂联用能降低药物的抑菌作用[10-11]，故采用这2种中和剂来消除成分复杂的根痛平片的抑菌作用。使用含中和剂的稀释剂制备供试品，需要制备成1∶100供试液，才能使3家企业的供试品对枯草芽孢杆菌的回收均为0．5～2，符合药典要求。

综上，平皿法和中和剂联用能消除根痛平片对枯草芽孢杆菌的抑制，可为其微生物限度检查方法提供参考。

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