LC3B、HDAC6和Nrf2在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者外周血中的表达

盛 青，谢 贝，刘志辉，马志明，谭俊豪

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)，是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的严重危害人类健康的疾病，气流受限多呈进行性发展，至2020年慢阻肺将居全球患者疾病死亡原因的第三位[1]。目前临床上慢阻肺的确切病因尚不明确，但多数人认为包括多种致病机制，如氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等[2-4]，而近年来有许多研究显示自噬作用也参与了慢阻肺的发生发展过程[5-7]。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)主要的改变是气道对香烟烟雾(CS)的异常炎症反应，这一炎性变化与气道上皮细胞功能失调、纤毛缩短和粘液纤毛清除障碍有关[8]。在LC3B敲除小鼠和这些小鼠来源的气管上皮细胞中，CS诱导的自噬水平下降，且纤毛缩短程度也减轻。组蛋白脱乙酰酶6 (HDAC6)是组蛋白去乙酰化酶(histone deace-tylases，HDACs)家族成员之一，是细胞内CS暴露期间自噬介导的纤毛缩短的重要调节因子，在HDAC6敲除小鼠和这些小鼠来源的气管上皮细胞中，CS诱导的自噬水平也下降以及纤毛缩短程度减轻[9]，其机制可能是通过去乙酰化作用介导LC3B的乙酰化修饰，进而促进自噬降解。而在自噬的信号通路中，LC3B已被证明受到乙酰化修饰的调控,进而影响其催化活性的发挥。另外，在LC3B和HDAC6敲除小鼠中，CS诱导的粘液纤毛清除障碍程度也更轻，而在Nrf2敲除小鼠中，CS诱导的粘液纤毛清除障碍程度更重[10]，且Nrf2能够调节CS诱导的LC3B表达，而且Nrf2是活性最强的转录调节因子。因此，在自噬的信号通路中，HDAC6能够调控LC3B的乙酰化修饰，促进自噬降解，且Nrf2能够调节LC3B的表达，进而调节自噬的形成，但其机制仍不清楚，有待进一步研究。

本文通过qRT-PCR检测慢性阻塞性肺疾病急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)患者外周血单个核细胞中LC3B、HDAC6和Nrf2的表达水平，并分析其与外周血白细胞总数、单核细胞百分比、淋巴细胞百分比及中性粒细胞绝对值的相关性，探讨自噬相关基因LC3B、HDAC6和Nrf2在AECOPD的发生发展中的作用。

1 资料和方法

1.1 研究对象 收集2016年9月至2017年5月在广州市胸科医院呼吸科住院的AECOPD患者36例，其中男性28例，女性8例，年龄47-85岁，所有COPD患者的诊断标准均符合2013年中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》。慢阻肺急性加重是指患者呼吸道症状超过日常变异范围的持续恶化，并需改变药物治疗方案，在疾病过程中，患者常有短期内咳嗽、咳痰、气短和(或)喘息加重，痰量增加，脓性或粘液脓性痰，可伴有发热等炎症明显加重的表现[1]。本研究经广州市胸科医院医学伦理委员会审核批准，所有患者签署知情同意书。纳入同期健康体检者21名为对照组，其中男性12名，女性9名，年龄43岁-78岁。

1.2 临床样本处理 分别收集慢阻肺急性加重患者及健康组外周血5mL至EDTA抗凝管中，用于分离外周血单个核细胞。取5mL PBS稀释外周血，将5mL的淋巴细胞分离液置于15 mL管底，缓慢地将稀释血液加入至分离液上，轻轻放置离心机中，2000 rpm，升速1，降速9，离心15 min，取中间白色层，2000 rpm离心5 min，留取白色沉底。

1.3 qRT-PCR检测 根据Total RNA Kit I说明书抽提总RNA(OMEGA公司)；RNA浓度和A260/280比率由紫外分光光度仪检测；通过PrimeScript®RT kit反转录成cDNA(TAKARA公司)；qPCR由SYBR Green PCR Master Mix按照标准步骤操作(上海美吉生物医药科技有限公司)；所有基因的mRNA与管家基因GAPDH以2-ΔΔCT函数值进行计算。

1.4 采用Graphpad prism 5.0进行分析，非配对t检验计算两组间差异，Pearson用于相关性分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 LC3B、HDAC6和Nrf2在外周血单个核细胞中的表达水平比较

检测外周血LC3B、HDAC6和Nrf2的基因表达水平，结果发现AECOPD患者外周血单个核细胞LC3B的表达水平(4.336±0.6328)明显高于健康对照(1.000±0.1522)，两者间差异具有统计学意义(P=0.0002)；HDAC6的表达水平(3.756±0.4612)明显高于健康对照(1.000±0.05988)，两者间差异具有统计学意义(P<0.0001)；同时Nrf2的表达水平(0.1786±0.01333)明显低于健康对照(0.8094±0.1111)，两者间差异具有统计学意义(P<0.0001)(见图1)。

图1： 健康组和AECOPD外周血单个核细胞LC3B、HDAC6和Nrf2的表达水平比较

2.2 AECOPD患者外周血LC3B、HDAC6和Nrf2的表达水平与白细胞总数、单核细胞百分比、淋巴细胞百分比及中性粒细胞绝对值的相关性分析

Pearson相关性分析如表1所示，AECOPD患者外周血LC3B的表达水平与白细胞总数呈正相关(r=0.5559，P=0.0314)，Nrf2的表达水平与白细胞总数无相关性(r=0.3909，P=0.1670)，同时LC3B的表达水平与中性粒细胞绝对值呈正相关(r=0.5968，P=0.0188)；HDAC6的表达水平与单核细胞百分比无相关性(r=0.2944，P=0.2684)，Nrf2的表达水平与单核细胞百分比呈负相关(r=-0.7531，P=0.0019)；LC3B和HDAC6的表达水平与淋巴细胞百分比无相关性(r=-0.3795，P=0.1630；r=0.3360，P=0.2032)，Nrf2的表达水平与淋巴细胞百分比呈负相关(r=-0.5819，P=0.0370)。

3 讨 论

随着环境等的变化，慢阻肺的患者人数日益增加，其中吸烟是重要的因素，因此提高人的环境保护意识及加强人们对吸烟危害的认识显得尤为重要。而在临床方面，如何预防和更好地治疗该疾病是目前一个迫切需要解决的问题，因此弄清楚其发病机制，有利于及时发现和治疗慢阻肺病人。

表1 AECOPD患者外周血LC3B、HDAC6和Nrf2的表达水平与白细胞总数、单核细胞百分比、淋巴细胞百分比及中性粒细胞绝对值的相关性分析

自噬可能影响人类疾病的进展，在调节细胞器内的稳态，蛋白质的周转，炎症反应，以及先天和适应性免疫反应中具有多种作用。大量的研究工作表明自噬在慢阻肺发病机制中的具有重要角色，从慢阻肺患者临床标本中也观察到自噬蛋白和自噬体数目的增加[11]。此外，有研究发现敲除自噬蛋白的基因后可以抑制慢性CS诱导的小鼠肺气肿的发展。

在自噬形成的过程中,多种自噬相关基因(autophagy-relatedgene,Atg)参与自噬泡的形成，其中微管相关蛋白1轻链3 (LC3)修饰过程对自噬泡的形成必不可少，与自噬泡的形成息息相关。研究表明，自噬蛋白LC3参与气道上皮自噬体的形成[10]。在慢阻肺病人中，自噬水平升高，LC3B-I表达水平下降，而LC3B-Ⅱ的表达增加，同时研究还发现LC3B在香烟诱导的细胞凋亡及肺气肿发展中具有重要的作用[11]。Zhu等[12]发现，香烟抽提物(CSE)能增加气道上皮细胞LC3B-II的表达及及吞噬小体的形成。但LC3B在慢阻肺急性加重患者外周血中的表达情况未见报道，为此我们研究了LC3B在AECOPD患者外周血中的表达水平并分析其与外周血白细胞总数和中性粒细胞绝对值的相关性。结果显示，LC3B在AECOPD患者外周血中的表达水平明显增加，同时与外周血白细胞总数和中性粒细胞绝对值均呈正相关，进一步论证了在慢阻肺患者的急性加重期，自噬水平是增加的；同时可能介导炎症细胞的增殖、迁移等炎症反应，可作为观察病情变化的一个分子指标。

在自噬的信号通路中，LC3B已被证明受到乙酰化修饰的调控,进而影响其催化活性的发挥，而组蛋白去乙酰酶6(HDAC6)是组蛋白去乙酰化酶蛋白家族成员之一，其研究时间最长，它的作用是通过去乙酰化作用促进细胞质基板如微管蛋白的细胞迁移等[13]。Lam[14]等发现细胞内HDAC6是吸烟暴露期间自噬介导气道纤毛缩短的一个关键因子。具有HDAC6(HDAC6-/Y)的X染色体缺失小鼠以及这些鼠的MTECs自噬水平低下，防御CS诱导的纤毛变化不明显。上述结果表明，HDAC6是气道上皮自噬反应过程中的重要因子。而我们的研究中发现HDAC6在AECOPD患者外周血中的表达水平明显增加，表明HDAC6在COPD的急性加重期间可促进自噬的形成，并通过相关性分析，发现其可能与炎症反应的形成密切相关。

Nrf2是CNC(cap’n’collar)转录因子家族成员中活力最强的转录调节因子，主要表达于如肝脏、肾脏等代谢和解毒组织中，以及其它持续暴露在环境中的组织如皮肤、肺、消化道等。与Nrf2+/+小鼠相比，长期暴露于香烟烟雾(4或6个月)的Nrf2-/-小鼠，将导致细胞自噬增加并抑制自噬相关蛋白的表达，形成更严重的肺气肿症状[15]，表明Nrf2可能是气道上皮自噬反应重要的调节子。而我们研究也发现Nrf2在AECOPD患者外周血中的表达水平明显下降，同时AECOPD患者外周血Nrf2的表达水平与外周血单核细胞百分比和淋巴细胞百分比均呈负相关，表明Nrf2在COPD的急性加重期可抑制自噬体的形成，并进一步抑制其炎症程度，同时也提示Nrf2可能调节AECOPD患者的免疫过程。

我们的这一研究表明，LC3B可与HDAC6和Nrf2一起作为观察AECOPD患者病情的分子标志物。从另一方面，也为我们预防和治疗慢阻肺提供了思路，我们或许可以利用分子靶向治疗的方法调节LC3B、HDAC6和Nrf2的表达水平，从而调节患者的自噬活性，抑制患者的炎症反应，最终达到治疗的目的。

由于本次的实验样本数量较少，不能全面地揭示自噬相关基因在慢阻肺急性加重发生发展中的具体作用，但创新性地发现慢阻肺急性加重患者的炎症反应与外周血LC3B、HDAC6、Nrf2的表达密切相关，为今后研究慢阻肺提供了新的思路。我们后续也将进一步对其作用机制做出研究，以确保得出最准确的结果。

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