癌-睾丸抗原MAGEC2 HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定*

胡东昊， 刘凤云， 谢金枝， 李伟宏

(1焦作职工医学院， 河南 焦作 454150； 2郑州澍青医学高等专科学校， 河南 郑州 450064)

在全球范围内，恶性肿瘤的发病率和死亡率一直很高，环境污染、生活习惯和人口老龄化等多种因素导致全球肿瘤患者继续增多。肿瘤的免疫治疗是通过激发和增强机体的免疫功能来控制和杀死肿瘤细胞[1]，这是继手术、化疗和放疗后一种有效的辅助治疗。随着肿瘤免疫治疗的发展，这一治疗方法越来越为人们看重。肿瘤的免疫治疗具有特异性强和副作用小的优点[2]。肿瘤的免疫治疗和肿瘤多肽疫苗的研究的前提条件是找到有效的肿瘤抗原特异性CTL表位。黑色素瘤相关抗原C2(melanoma-associated antigen C2,MAGEC2)是一种新型癌-睾丸(cancer-testis，CT)抗原。在正常组织中，仅在睾丸中检测到MAGEC2 的mRNA表达；但是在肝癌、恶性黑色素瘤和膀胱癌中具有高水平的MAGEC2表达[3-5]。用于肿瘤患者的肽疫苗目前正处于临床研究的活跃阶段。然而，基于肽的免疫治疗受人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-A等位基因的高度限制。在中国人群中，HLA-A2超型占45%左右，HLA-A3超型超过50%[6]，所以寻找并鉴定MAGEC2的HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte,CTL)表位对肿瘤的免疫治疗具有重要意义。本次研究使用BIMAS、SYFPEITHI和IEDB等生物信息学软件进行综合预测[7-9]，筛选出综合打分较高的表位，并通过鉴定筛选出MAGEC2的HLA-A3限制性CTL表位。

材 料 和 方 法

1 材料

T2A3细胞由焦作职工医学院实验室常规保存，采用37 ℃、5% CO2饱和湿度培养条件下常规培养。人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLA-A3+健康供者捐赠。HLA-A3+外周血健康供者来自医院寻找的健康志愿者。

2 方法

2.1HLA-A3限制性CTL表位肽的预测 使用BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和IEDB(http://tools.iedb.org/main/tcell/)软件对MAGEC2氨基酸序列进行预测打分，CTL表位限制性MHC类型为HLA-A*03，预测抗原肽长度为9 aa (nona-mers)。根据各个预测软件所推选的前20个优势表位进行综合选择，选出在各种软件打分较好的HLA-A3超型限制性表位。

2.2HLA-A3限制性CTL表位肽的合成 候选表位肽由上海生工生物工程有限公司合成，经高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)分析纯化后，其纯度>95%。采用电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)鉴定多肽，条件设置：喷雾器压力为7.0或11.0 Psi；干燥器流速为4.0或8.0 L/min；温度300 ℃；喷雾针电压4.0 kV。G2025A Software A.02.01数据分析软件检测精肽的分子质量。

2.3表位肽与HLA-A3分子结合力实验 收集T2A3细胞，用无血清RPMI-1640培养基洗3次，调整细胞密度至1×109/L，铺于24孔板中(每孔1 mL)，每实验孔加入待测肽50 μmol/L和β2-微球蛋白(Merck)3 mg/L，37 ℃、5% CO2共孵育18 h后，冷PBA洗涤3次，加入500 μL稀释度为1 ∶100的单克隆抗体(鼠抗人β2-微球蛋白)，4 ℃避光静置40 min。之后冷PBA洗涤3次，加入50 μL稀释度为1 ∶50的FITC-羊抗鼠抗体溶液，4 ℃静置40 min，PBA洗涤1次后上流式细胞仪检测，结果用荧光系数(flourescence index，FI)表示。FI=(表位肽平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度。FI>1.0表示高等结合力，0.5

2.4CTL的体外诱导 抽取20 mL健康志愿者血液，经常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心，获取PBMCs，用含10%胎牛血清的IMDM培养基调整细胞浓度为1.5×109/L。第2天分别加入10 mg/L的候选肽共培养，第3天加入3×104U/L的重组人白细胞介素2(recombinant interleukin-2，rIL-2；Promega)继续培养。每周收集细胞，1 000 r/min离心10 min，除去上清液，加入新鲜的含10%胎牛血清的IMDM培养基，同时加入上述条件的候选肽和rIL-2。刺激3轮后于最后 1 次刺激的第3天收集细胞。调整细胞密度作为效应细胞，荷肽的T2A3细胞作为靶细胞，用无血清IMDM培养基调整细胞密度[11]。

2.5干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)分泌水平的检测 取出酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)实验板条(购自达科为生物技术有限公司)，加200 μL无血清的IMDM培养基进行封闭，静置10 min；诱导的CTL作为效应细胞，荷肽的T2A3细胞作为刺激细胞，细胞密度均调整为2×109/L；设立对照孔和实验孔；37 ℃、5% CO2孵育18 h；倾尽孔中培养基，每孔加入200 μL无菌的去离子水，4 ℃ 裂解细胞10 min；倾尽孔内液体，加入200 μL 1×Washing Buffer 洗涤6次，每次停留60 s；加入 100 μL生物素标记的抗体，37 ℃ 孵育1 h；倾尽孔内液体，加入200 μL 1×Washing Buffer进行洗涤，方法同上，在吸水纸上拍干；加入100 μL酶联亲和素，37 ℃ 孵育1 h；每孔加入200 μL 1×Washing Buffer进行洗涤，方法同上；加入100 μL现配的AEC显色液，25 ℃避光静置30 min；结束后置于通风处，室温静置干燥；结果用 ELISPOT 图像分析仪计数 96 孔板中每孔的斑点数。

2.6乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)细胞毒活性检测 调整CTL密度为5×109/L；荷肽的T2A3细胞作为靶细胞，调整靶细胞密度为1×108/L；按50 ∶1、25 ∶1和12.5 ∶1的不同效靶比铺于96孔板中，同时设立效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、体积校正组和背景对照组，每孔终体积为100 μL。37 ℃、5% CO2培养4 h。于孵育结束前45 min，在靶细胞最大释放组及体积校正组中加入10 μL裂解液。1 000 r/min离心4 min，转移50 μL上清至另一干净96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室温避光孵育30 min；每孔再加入50 μL终止液。用酶标仪检测其在490 nm波长处的吸光度(A)。杀伤率(%)=(实验孔A值-效应细胞自发释放A值-CTL自发释放A值)/(靶细胞A值-效应细胞自发释放A值)×100%。

2.7羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)荧光染色检测细胞毒性实验 离心收集靶细胞，并将细胞重悬于含有1%FCS的PBS中，并将细胞密度调节至1×109/L。致敏靶细胞：每1 mL细胞悬浮液加入0.5 μL 5 mmol/L CFSE(购自Sigma)，室温，光照孵育4 min。对照靶细胞：每1 mL细胞悬液中加入0.5 μL 100 μmol/L CFSE，室温，光照孵育4 min。将细胞用5% FCS-PBS洗涤1次，离心并除去上清液，将细胞重悬于无血清IMDM培养基中。将效应细胞在无血清IMDM培养基中洗涤1次，并以(1.25～5.00)×109/L的密度重悬于无血清IMDM培养基中。将效应细胞与致敏的靶细胞(效靶比分别为12.5 ∶1、25 ∶1和50 ∶1)在离心管中混合，靶细胞数为2×104，在37 ℃温育4 h 孵育后，用含有1% FCS和0.1%叠氮化钠的PBS(FACS)处理相同效靶比的致敏靶细胞组和对照靶细胞组，并用FACS洗涤。离心，重悬在含4%多聚甲醛的PBS溶液中，上流式细胞仪检测。杀伤率(%)=(对照样品中致敏靶细胞的数量-测试样品中致敏靶细胞的数量)/对照样品中致敏靶细胞的数量×100%。

3 统计学处理

实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析检验多组平均数之间的差别，采用SPSS 16.0标准版统计软件包进行数据分析，用GraphPad Prism软件绘图，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MAGEC2 HLA-A3限制性CTL表位的预测结果

为了预测MAGEC2开放阅读框中潜在的HLA-A3超型限制性CTL表位，我们依据BIMAS、SYFPEITHI和IEDB软件的结果，选取在各个预测软件中分值排名靠前的表位肽，根据这3个预测软件进行综合打分，筛选出分值在各个软件中打分较好的CTL表位肽，打分情况见表1。使用质谱仪测定候选表位肽的分子量，结果显示各多肽分子量测定值与理论值相符，表明合成的多肽是我们所需要的目的肽，见表2。

表1 MAGEC2 HLA-A3限制性CTL表位预测结果

2 表位肽与HLA-A3分子结合力实验结果

T2A3结合力实验测试表位肽与HLA-A*03的结合能力。使用流式细胞术进行检测，对所得到的数据进行处理，结果表明P147、P167、P196、P229和P251均具有较好的结合HLA-A*03的能力(FI>0.5)，见表2。

表2候选肽与HLA-A*03分子结合力结果

Table 2. The HLA-A*03 binding affinity of the peptides derived from MAGEC2

PeptideESI-MS[M+H]+CalculatedObservedFIP471046.21047.20.26P129937.9938.70.34P1401017.11018.50.37P1471103.41105.40.68P1671138.51139.30.76P1751122.41122.60.34P196950.0950.70.98P229996.3995.50.86P2321045.41046.50.45P251963.1964.20.88P2571035.11038.60.33HBcAg18-271155.31155.61.58

FI = [mean fluorescence intensity (MFI) of the peptide-MFI background]/MFI background.

3 IFN-γ分泌水平结果

为了检测各表位肽是否可被MAGEC2抗原特异性的CD8+T细胞识别，根据结合力的实验结果，我们选择了较好结合力的多肽进行实验，结果显示P167、P196和P251多肽疫苗能检测到特异性T细胞免疫，能分泌较多的IFN-γ，见图1。

Figure 1. ELISPOT assay was conducted to measure the IFN-γ release by CTLs induced from the PBMCs of healthy donors. CTLs induced by PBS and HBcAg18-27were taken as negative controls. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

图1ELISPOT法检测MAGEC2候选表位肽诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力

4 细胞毒实验结果

根据IFN-γ分泌水平结果，我们将有效果的P167、P196和P251进行进一步的免疫活性检测；P196和P251这2条候选肽诱导得到的CTL在效靶比为50 ∶1时对靶细胞的杀伤率较阴性对照组和无关肽组在效靶比为50 ∶1时对靶细胞的杀伤率均显著升高(P<0.01)，见图2。

5 CFSE荧光染色检测细胞毒性实验结果

候选肽所诱导产生的CTL，随着效靶比的提高杀伤效果相应得到提高，P196和P251这2条候选肽诱导得到的CTL在效靶比为50∶1时对荷肽T2A3细胞的杀伤率分别较阴性对照组和无关肽组显著升高(P<0.01)，见图3。

讨 论

随着社会发展，日益突出的环境问题及人们生活方式的改变引发了一系列的健康问题，其中最为令人关注的问题之一就是有着上升趋势的肿瘤发病率。肿瘤的手术摘除及放疗、化疗的联合应用在临床治疗上有一定的治愈率，但术后的复发率及毒副作用也是困扰人们的问题之一。特别是恶性肿瘤，其高转移性更是令人们束手无策。而随着生物信息学及分子免疫学的发展，人们对人体免疫系统有了更深的认识，利用自身免疫系统来治疗疾病已经成为可能。肿瘤的免疫治疗作为一种新兴的肿瘤治疗方式引起了更多的关注[12-13]。

Figure 2. Specific lysis of target cells by the CTLs generated from the PBMCs of healthy donors. The levels of LDH release were detected.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

图2候选肽P196和P251诱导得到的CTL在不同效靶比时对靶细胞的杀伤情况

Figure 3. Detection of antigen-specific cytotoxicity by FACS-CTL assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

图3CFSE法检测特异性CTL的体外细胞毒实验结果

肿瘤疫苗作为肿瘤生物治疗的重要组成部分，为肿瘤的治疗和预防开辟了新途径。近年来肿瘤疫苗的研究在国内外逐渐受到重视，并且得到了十分迅速的发展[14]。肿瘤疫苗的基本原理是通过激活患者自身的免疫系统，主要通过利用肿瘤细胞和肿瘤抗原物质诱导机体产生特异性细胞免疫或者体液免疫反应，增强机体的抗肿瘤能力，阻止肿瘤的生长、转移扩散和复发，最终达到清除或抑制肿瘤的目的[15]。多肽疫苗近年来已经获得了很多关注，在对抗肿瘤和病毒疾病是一种有效且安全的治疗方式。针对肿瘤抗原的研究表明，在肿瘤细胞表面存在许多抗原多肽，这些抗原多肽可以有效地激发机体产生一系列针对该肿瘤细胞的免疫应答反应[16]。通过对肿瘤抗原编码基因的序列分析，筛选其被 CD8+T淋巴细胞识别的抗原表位，构建多肽疫苗，能够加强HLA 和 TCR 的结合，而且还可以通过氨基酸替换、改变肽的构象以及修饰氨基酸残基等方法提高肽的免疫原性[17]。

近年来的研究报道显示，用表达于肿瘤细胞表面的肿瘤抗原的 CTL 表位肽刺激机体可以很好的产生抗原特异性的 CTL 细胞，进而参与针对肿瘤的免疫应答并发挥出较好的抗肿瘤效应。反向免疫学方法被广泛应用，并被证明是鉴定肿瘤相关肽的有效方法[18]。使用这种方法，已经从人类TAA鉴定了大量的CD8+T细胞表位，例如PBF[19]，PIWIL2[20]和MUC4[21]等。生物信息学的方法预测肿瘤表位，可以减少实验的盲目性，对前期实验的筛选很有帮助。BIMAS软件是依据肽-MHC分子复合物的分裂半衰期原理来预测HLA限制性表位；SYFPEITHI软件则是基于表位肽的一级结构及与MHC结合的长度和结和力等因素的预测手段。IEDB是基于序列的线性表位预测工具。因此将SYFPEITHI和BIMAS的预测结果结合然后综合IEDB表位预测软件打分结果分析。3种不同的在线预测软件的使用，可以提高表位预测的准确性。

在本次研究中， P196和P251的免疫原性已在体外实验中展示，结果显示P196和P251能有效诱导MAGEC2+HLA-A3+限制性CTL，能够识别和裂解自然递呈野生型MAGEC2表位的靶细胞。但其在体内抗肿瘤免疫诱导中的效力仍有待确定。肿瘤表位肽在肿瘤治疗中发挥了重要作用，但应该加大力度提高其治疗潜力[22-23]。我们应该继续探索具有抗肿瘤特性的新型表位肽，通过开发更多的肽库和新技术来提高肽的肿瘤靶向能力。通过开发具有非天然氨基酸的新型肽，以提高其高度特异性和有效抗肿瘤活性，从而克服天然肽半衰期短的缺点。我们应该设计更可靠和有效的修饰策略，以提高生物活性肽的抗癌效果和结构稳定性。纳米技术也可以用于表位肽药物的开发，它可以使表位肽持续释放或者具有靶向功能[24]。

[参 考 文 献]

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