白细胞介素22抗体抑制Snail1高表达对糖尿病肾病的影响*

刘 意， 赵林双

(中国人民解放军武汉总医院内分泌科， 湖北 武汉 430070)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是高发且缩短患者生存年限、严重影响患者生存质量的糖尿病并发症之一。流行病学研究发现几乎1/3的糖尿病患者受DN影响，最终50%发展为终末期肾病[1]。2016年美国糖尿病协会科学年会指出，慢性低度炎症参与糖尿病病程，而干预慢性低度炎症利于糖尿病好转[2]。可见慢性低度炎症在DN并发症发生发展中起着不可忽视的作用[3]。

白细胞介素22(interlukin-22，IL-22)属IL-10细胞因子家族，参与宿主屏障组织防御。IL-22受体(IL-22 receptor，IL-22R)由IL-22R1和IL-10R2异二聚体亚基组成，IL-22与IL-22R1有高度亲和性和专一性。与其它大多数作用于造血细胞的细胞因子不同，IL-22R1在免疫细胞缺如，而只表达于肺脏、肝脏、肾脏和胰腺等组织非造血上皮细胞和成纤维细胞[4-5]。

最近研究发现， IL-22在2型糖尿病患者高表达[6-7]。还有研究表明,IL-22可以促进组织器官纤维化[8-9]。肾小管上皮细胞是表达IL-22R1的主要细胞[4]，IL-22可能在DN发病机制中起重要作用。IL-22/IL-22R1系统近期已被认为在代谢性疾病中有重要的药物发展前景[10-11]。但关于IL-22在DN发生发展中的作用尚无文献报道。本研究通过构建糖尿病小鼠模型，探讨IL-22在DN发生发展中的作用及具体机制，为治疗DN提供新的思路和理论依据。

材 料 和 方 法

1 动物

24只SPF级5～6周龄C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物合格证编号：11400700167238)，体重16～18 g。饲养环境：室温20～24 ℃，相对湿度40%～60%，自由摄食饮水，12 h交替照明。

2 主要试剂

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ； Sigma)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA； Biosharp)；重组IL-22(recombinant IL-22, rIL-22； PeproTech)；IL-22中和抗体(IL-22 antibody,anti-IL-22; PeproTech)；抗纤维连接蛋白(fibronectin，FN) 抗体和抗E-钙黏素(E-cadherin)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；TRIzol(Aidlab)；cDNA第一链合成试剂盒(Vazyme)；PCR引物由武汉擎科生物有限公司合成。

3 主要方法

3.1糖尿病小鼠模型的建立 18只小鼠适应性喂养1周后，予以高脂饲料(普通饲料中加入2%胆固醇、0.15%胆酸钠、10%蔗糖和10%猪油)喂养4周，禁食10 h后按50 mg/kg剂量腹腔注射STZ溶液，连续5 d，另取6只普通饲料喂养小鼠腹腔注射等量柠檬酸缓冲液作为正常对照(normal control，NC)组。1周后剪尾法测随机血糖≥13.9 mmol/L为造模成功。

3.2实验动物干预及分组 造模成功后，糖尿病模型小鼠继续高脂喂养8周，随机分为DN组(n=6)、rIL-22干预组(DN+rIL-22组，n=6)和anti-IL-22干预组(DN+anti-IL-22组，n=6)。分组干预如下：(1)DN+rIL-22组：rIL-22 200 μg/kg，每周2次，连续4周，腹腔注射；(2)DN+anti-IL-22组：anti-IL-22 200 μg/kg，每周2次，连续4周，腹腔注射；(3)DN组：等量0.1% BSA腹腔注射，每周2次，连续4周；(4)NC组：等量0.1% BSA腹腔注射，每周2次，连续4周。

3.3血糖、肾功能、24 h尿微量白蛋白(microalbumin，m-Alb)和24 h尿肌酐(urine creatinine,UCr)的检测 用血糖仪以剪尾法测定各组小鼠干预前和干预后的空腹血糖(fasting plasma glucose， FPG)，全自动生化仪检测血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、24 h m-Alb和24 h UCr，并计算m-Alb/UCr比值。

3.4肾脏指数(kidney index,KI)的计算 实验结束后，小鼠称重，腹腔注射1%水合氯醛50 mg/kg麻醉。留取肾脏标本，称重，计算KI。KI (%)=双侧肾脏重量(g)/体重(g)×100%。

3.5光镜下观察肾脏组织的病理结构改变 取4%多聚甲醛常温固定的小鼠肾脏组织，常规的梯度脱水、石蜡包埋、切片(5 μm)，做常规HE染色，光镜下观察肾脏组织病理形态学改变。

3.6肾小管间质损伤的评分标准 肾小管间质各项病理指标包括肾小管萎缩、肾间质纤维化和炎性细胞浸润3项半定量评分。采用Katafuchi计分标准，肾间质积分0～9分，间质炎性细胞浸润0～3分，间质纤维化0～3分，肾小管萎缩0～3分。综合积分作为标本肾小管间质损伤评分标准，记为肾小管损伤分数(score of tubular injury STI)。

3.7qPCR法检测肾脏组织Snail1的mRNA表达 取出-80 ℃冻存的新鲜肾脏组织，以TRIzol试剂盒提取肾脏组织总RNA，分光光度计进行RNA浓度测定。Snail1的上游引物为5’-CACCCTCATCTGGGACTCTC-3’，下游引物为5’-TTGCCACTGTCCTCATCGG-3’；β-actin的上游引物为5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下游引物为5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’。使用ABI 7900实时荧光PCR仪，qPCR反应严格依试剂盒操作说明进行。扩增条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸25 s，30次循环；继续72 ℃延伸4 min，4 ℃ 4 min。扩增完成后，50 ℃开始升温做熔解曲线，基因相对表达量以2-ΔΔCt值计算分析。

3.8Western blot法检测肾脏组织FN和E-cadherin的蛋白表达 提取肾脏总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。经过10%的SDS-PAGE分离，PVDF膜印迹，5%脱脂奶粉室温封闭。加入抗FN(1 ∶1 000)抗体和抗E-cadherin抗体(1 ∶5 000)，4 ℃孵育过夜后，加辣根过氧化物酶标记的 II 抗(1 ∶50 000)孵育2 h。洗涤后经增强化学发光显影，曝光成像。以β-actin作为内参照，计算蛋白条带的灰度比值进行半定量分析，结果由计算机凝胶图像分析系统检测。

4 统计学处理

应用SPSS 22.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较选用单因素方差分析(ANOVA)，组间多重比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠血糖、肾功能和肾脏指数的比较

NC组小鼠体型正常，毛柔顺且色泽乌黑，反应灵敏；各糖尿病模型组小鼠体型肥胖，毛粗糙且色泽暗淡，反应稍迟钝。干预前和干预4周后，与NC组小鼠比较，各糖尿病模型组小鼠FPG均显著升高(P<0.01)，但各组间KI和肾功能的差异无统计学显著性，见表1。

表1 各组小鼠血糖、肾功能和肾脏指数的比较

**P<0.01vsNC group.

2 各组小鼠干预后微量白蛋白尿的比较

干预4周后，与NC组小鼠比较，各模型组24 h尿微量白蛋白/肌酐比值均显著升高(P<0.05或P<0.01)，出现微量白蛋白尿，提示进展为糖尿病肾脏病变。另外，rIL-22干预4周后，相较于DN组，24 h m-Alb和24 h UCr均显著升高(P<0.05)，而anti-IL-22阻断4周后，24 h m-Alb、24 h UCr和24 h尿微量白蛋白/肌酐比值较DN组和DN+rIL-22组均显著降低(P<0.05)，说明anti-IL-22可减轻糖尿病肾病白蛋白尿，见表2。

表2 各组小鼠干预后微量白蛋白尿的比较

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsDN group;△△P<0.01vsDN+rIL-22 group.

3 肾脏病理学改变的比较

NC组小鼠肾脏体积正常，质地柔软；各糖尿病模型小鼠肾脏体积增大，质地变硬。HE染色后光镜下可见，NC组小鼠肾小球体积正常，肾小管上皮细胞形态规则、边界清晰，管腔规则，未见明显扩张；而DN组肾小管上皮细胞空泡变性、细胞核溶解、细胞边界不清，肾小管管腔不规则，部分管内有蛋白管型；肾小球体积增大，系膜细胞增多、系膜增宽；DN+rIL-22组较DN组上述病变更为广泛，而DN+anti-IL-22组上述病变明显减轻，见图1。

Figure 1. The pathological changes of renal tissues under light microscope (HE staining, ×400).

图1光镜下肾脏组织病理学改变

4 肾小管间质损伤的半定量分析

rIL-22干预4周后，DN+rIL-22组STI为7.17±0.75，较NC组(1.60±0.27)和DN组(4.63±0.58)均显著升高(P<0.01)；而anti-IL-22阻断4周后，STI为3.01±0.52，较DN组显著下降(P<0.05)。

5 各组小鼠干预后肾脏Snail1 mRNA表达水平比较

qPCR结果显示，干预4周后，与NC组小鼠比较，DN组和DN+rIL-22组Snail1的mRNA表达均显著升高(P<0.05)；而anti-IL-22阻断4周后，Snail1的mRNA表达较DN组显著降低(P<0.05)，见图2。这说明anti-IL-22可以抑制糖尿病小鼠肾脏组织Snail1信号分子高表达。

6 各组小鼠干预后肾脏FN蛋白表达水平的比较

Western blot实验结果显示，rIL-22干预4周后，FN蛋白表达水平较NC组和DN组均显著升高(P<0.05或P<0.01)；而anti-IL-22阻断4周后，FN蛋白表达水平较NC组显著升高(P<0.05)，但与DN组比较差异无统计学显著性，见图3。这说明IL-22可诱导FN蛋白表达，加速细胞外基质积聚引起的糖尿病肾纤维化。

Figure 2. The relative mRNA expression level of Snail1 in the kidney among different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDN group.

图2各组小鼠肾脏组织Snail1的mRNA相对表达水平

Figure 3. The relative protein expression level of FN in the kidney among different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsDN group.

图3各组小鼠肾脏组织FN蛋白的表达水平

7 各组小鼠干预后肾脏E-cadherin蛋白表达水平比较

Western blot实验结果显示，rIL-22干预4周后，DN+rIL-22组E-cadherin蛋白表达水平较NC组和DN组均显著下降(P<0.05)，见图4。这说明IL-22抑制间质细胞标志物E-cadherin蛋白表达，加速上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程，从而促进糖尿病肾纤维化。

讨 论

炎症的标志是炎症细胞渗透、黏附分子表达和趋化因子、促炎细胞因子、血清C反应蛋白升高。慢性低度炎症发生于慢性、低级别水平，和传统炎症性疾病相比相当轻微[3]。目前认为，“2型糖尿病是一种慢性低度炎症性疾病”[2]。而炎症因子可能参与了2型糖尿病和DN并发症发生发展[3]。最近研究发现[6-7]，IL-22在2型糖尿病患者升高。IL-22可以促进组织器官纤维化[8-9]，而肾小管上皮细胞是表达IL-22R1的主要细胞[4]，因此有必要探讨IL-22在糖尿病肾病发生发展中的作用。

Figure 4. The relative protein expression levels of E-cadherin in the kidney among different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDN group.

图4各组小鼠肾脏组织E-cadherin蛋白相对表达水平

本研究发现，anti-IL-22可以减轻糖尿病肾病白蛋白尿，延缓DN进程。研究结果显示，糖尿病模型小鼠24 h尿微量白蛋白/肌酐比值均显著升高，出现白蛋白尿，提示进展为糖尿病肾脏病变。而anti-IL-22阻断4周后，24 h尿微量白蛋白/肌酐比值显著下降，表明白蛋白尿得到改善，为今后以IL-22为靶点治疗DN提供理论依据。白蛋白尿是糖尿病肾病早期阶段和特征性表现，通常作为评估药物疗效的终点事件[12]。

我们通过光镜观察进一步证实，rIL-22促进DN发生发展，而anti-IL-22可改善DN。我们发现，糖尿病小鼠肾小管上皮细胞空泡变性、蛋白管型形成和肾小球系膜扩张，rIL-22干预4周后上述病变更为广泛，反之anti-IL-22阻断4周后病变程度得以减轻。可见，IL-22在DN发病机制中起着不可忽视的作用。

Snai1基因编码Snail家族锌指蛋白1，以Snail1蛋白著称[13]。“上皮可塑性”指在肾脏，一些肾小管上皮细胞变为更接近间充质细胞，而另一些则回到上皮表型或保留去分化状态。“部分EMT”指极少甚至没有肾小管上皮细胞，可以真正穿越基底膜彻底转化为纤维母细胞[14]。而糖尿病肾纤维化主要由EMT[15]、细胞外基质积聚和肾小管上皮细胞凋亡引起[16]。FN是一种细胞外基质蛋白，为细胞外基质积聚标志物[16]。E-cadherin主要表达于上皮细胞，为EMT发生标志物[15]。有研究表明，Snail1可以阻止肾小管上皮细胞的最终分化，诱导部分EMT促进肾纤维化发展[13-14,17]。

本研究还发现，糖尿病肾病小鼠Snail1转录因子高表达，anti-IL-22可能通过抑制肾小管上皮细胞Snail1信号分子表达改善DN。qPCR结果显示，糖尿病肾病小鼠肾脏组织Snail1的mRNA表达水平显著升高，而anti-IL-22能够抑制Snail1的mRNA表达。

本研究结果表明，rIL-22可以促进ECM积聚和诱导EMT进程，加速糖尿病肾病发生发展。Western blot结果显示，rIL-22可以增加糖尿病小鼠肾脏组织FN表达，而抑制肾脏组织E-cadherin蛋白表达。

不同剂量和时长药物干预可能发挥不同药效，本研究结果未显示rIL-22对Snail1产生显著影响。因此，最佳的剂量和时长有待进一步探索，其它可能参与信号通路机制也有待深入发掘。

IL-22R1除与IL-22结合外，还可与IL-20和IL-24结合，以IL-22R1依赖性方式产生IL-22样效应。因此，中和IL-22后并不能完全阻断IL-22发挥生物效应[4,10]。本研究结果未显示给予anti-IL-22后对FN和E-cadherin产生显著影响，可能与代偿机制有关。反之，阻断IL-22R1也许比中和IL-22能发挥更完全的阻断效应[10]。后续研究，还须深入探讨应用IL-22R1抗体(IL-22 receptor-1 antibody，IL-22RA1)阻断IL-22R1后对糖尿病肾病保护机制。

从上述研究结果我们得知，IL-22抗体可能通过抑制肾小管上皮细胞Snail1信号分子高表达而减轻糖尿病肾病白蛋白尿，延缓DN进程。本研究尚存在一些不足之处，课题组未检测IL-22在模型动物和干预动物中的表达水平。在下一步的工作中，课题组将进一步证明实验干预对糖尿病肾病产生的影响。

[参 考 文 献]

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