PCA通过NF-κB和AP-1信号通路影响HUVECs表达TF*

靳 文， 张根葆,2△， 高恬媛， 桑金凤

(皖南医学院 1病理生理学教研室， 2蛇毒研究所， 安徽 芜湖 241002)

尖吻蝮蛇毒蛋白C 激活剂(Agkistrodonacutusvenom protein C activator，PCA)是从皖南蝮蛇和尖吻蝮蛇蛇毒中分离、纯化得到的一种蛋白C激活剂，用于抗凝实验的研究[1]。血栓性疾病是临床上的常见病，严重威胁人类的生命健康[2]。血栓的形成是多因素的(如手术、外伤、败血症、肿瘤及充血性心力衰竭等)，研究表明，各因素导致血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)损伤后，大量组织因子(tissue factor，TF)合成与释放，以致凝血途径被激活是血栓性疾病发生发展的重要因素[3]。细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为一种炎症致病因子诱导血管内皮细胞表达TF[4]。有报道认为，LPS引起血管内皮细胞损伤过度分泌TF，主要是通过细胞内的肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6，TRAF6)泛素化激活转录途径来实现的[5-7]。而人类内皮细胞TF的表达主要是由于核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)家族p65和活化蛋白1(activator protein-1，AP-1)家族Fos-Jun异二聚体的激活所致[8]。本实验室已证实PCA可抑制LPS损伤的VECs合成分泌TF，保护VECs，发挥抗凝作用[9]。因此，推测PCA减少TF的合成分泌，可能是通过抑制核因子的活化和TF基因的表达有关。根据前期实验的结果[10]，本实验选取1.25 mg/L PCA作用于人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，通过观察PCA对HUVECs活性、TRAF6活化、NF-κB p65、c-Fos、c-Jun蛋白及TF基因表达的影响，进一步探讨PCA减少TF分泌的机制。

材 料 和 方 法

1 材料与仪器

皖南五步蛇蛇毒PCA组份由皖南医学院蛇毒研究所提供；DMEM完全培养基和PBS缓冲液(Thermo)；0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA、青霉素-链霉素双抗、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、彩色预染蛋白质分子量标准、SDS-PAGE凝胶试剂盒、Western blot半干转膜液、超敏ECL发光液和PMSF试剂(江苏碧云天)；胎牛血清(杭州四季青公司)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)和DAB显色试剂盒(博士德)；LPS、MTT和DMSO(Sigma)； 本实验所用I抗(Abcam)；引物(上海生工生物工程公司)；PCR逆转录试剂盒和扩增试剂盒(TIANGEN)；人TF因子ELISA试剂盒(上海源叶生物有限公司)；其它试剂均为国产生化分析纯。超净工作台(上海三发科学仪器有限公司)；5% CO2培养箱(Thermo)；荧光倒置显微镜(Olympus)；细胞计数仪(上海睿钰公司)；恒温水浴箱(上海医用设备厂)；酶标仪(Sunrise)；电泳仪、半干转膜仪、qPCR仪和ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(Bio-Rad)。

2 方法

2.1细胞培养与实验分组 HUVECs购自上海酶研生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养，取长满80%左右的HUVECs换液并进行传代，选取生长状态良好、形态正常的细胞用于实验。

实验分为空白对照(control)组、LPS组、PCA组和PCA+LPS组。空白对照组加入DMEM完全培养基，LPS组加入0.1 mg/L LPS，PCA组加入1.25 mg/L的PCA 溶液，PCA+LPS组加入1.25 mg/L PCA与0.1 mg/L LPS的混合液。各组均于药物作用12 h后进行后续实验。

2.2MTT法检测细胞活力 HUVECs接种于一次性96孔板中。待细胞贴壁生长状态良好时，各组加药。继续培养细胞12 h，于结束前4 h加入浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL，放培养箱培养4 h后吸净细胞上清，每孔加入150 μL DMSO，水平摇床振荡摇匀10 min，在酶标仪上于490 nm处测定吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率(inhibition ratio，IR)。生长抑制率(%)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

2.3免疫组化法检测TRAF6蛋白在细胞中的分布 HUVECs接种于一次性6孔板中培养，各组加药。弃去培养液，依次加入4%多聚甲醛、0.5% TritonX-100及3%过氧化氢处理；吸去3%过氧化氢，加入试剂A液(封闭用正常山羊血清工作液)，室温封闭；加入用PBS缓冲液稀释的 I 抗，4 ℃冰箱过夜。第2天从冰箱中取出6孔板，再依次加试剂B液(生物素化 II 抗工作液)和试剂C液(辣根酶标记链霉卵白素工作液)处理；去掉试剂C液，加入已配好的DAB工作液显色。加入苏木素溶液复染，充分水洗，加入1%盐酸乙醇脱色，水洗。梯度乙醇脱水，甩干，显微镜下观察，拍照。用Image-Pro Plus 6．0软件分析平均吸光度。

2.4Western blot检测细胞内NF-κB p65、c-Jun、c-Fos及TF蛋白的表达 选取生长状态良好的细胞，加药处理，冰上提取细胞蛋白并测蛋白浓度，按照比例加入蛋白上样缓冲液(5×)，混匀煮沸以使蛋白变性，冷却至室温后放入-20 ℃冰箱保存备用。配胶、上样、电泳，电泳结束后切胶转膜。结束后，牛奶封闭，加 I 抗孵育，抗体孵育盒放入4 ℃冰箱过夜。第2天取出膜，加入稀释好的 II 抗，水平摇床上室温孵育2 h。洗膜后滴加ECL发光液，放置于凝胶成像显影仪中成像。最后用ImageJ软件分析条带灰度值。

2.5qPCR检测HUVECs的TF的mRNA表达 选取生长状态良好的细胞，加药处理，TRIzol试剂提取总RNA；打开NANO DROP2000分光光度计，测总RNA浓度及A260/A280比值。按试剂盒说明书操作，逆转录合成cDNA,再进行qPCR反应，配制20 μL qPCR反应体系，混匀，离心，将反应体系置于qPCR仪，设置反应条件： 50.0 ℃，2 min循环1次； 95.0 ℃ 5 min循环1次； 95.0 ℃ 15 s及60 ℃ 1 min，循环40次。β-actin的上游引物序列为5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游引物序列为 5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’；TF的上游引物序列为5’-TGAAGGATGTGAAGCAGACG，下游引物序列为5’-GCCAGGATGATGACAAGGAT-3’。用2-ΔΔCt法分析mRNA的相对表达水平。

2.6ELISA法检测HUVECs培养上清液中TF的表达 选取合适的细胞，接种于一次性6孔板中培养，各组加药。收集各组细胞培养上清液。按ELISA试剂盒上的步骤进行操作，加样，孵育洗涤，显色，终止显色，在酶标仪上于450 nm处测定A值，制作标曲计算TF浓度。

3 统计学处理

用SPSS 18.0软件进行数据处理和统计分析。各组实验数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异用单因素方差分析，两两间比较采用SNK-q检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 PCA明显抑制LPS所致的HUVECs活力的变化

MTT法检测细胞活力，结果可见，LPS组细胞的A值与对照组比较显著下降，细胞活力降低(P<0.01)；PCA组的A值与对照组比较差异无统计学意义；PCA+LPS组与LPS组比较，细胞A值大于LPS组，细胞活力上升(P<0.05)，见表1。

2 HUVECs中TRAF6蛋白的分布

免疫组化实验结果显示，对照组HUVECs呈梭形，边界清晰，胞质内黄染颗粒不明显；LPS组细胞胞质内出现明显的黄染颗粒，胞质染色加深，TRAF6 平均吸光度值升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；而LPS+PCA组与LPS组比较，细胞形态正常，胞质黄染颗粒不明显，TRAF6平均吸光度明显小于LPS组(P<0.01)，见图1、表1。

表1PCA逆转LPS所致的HUVECs活力的变化和TRAF6蛋白的表达

Table 1. PCA reversed LPS-induced changes of HUVECs viability and protein expression of TRAF6 (Mean±SD.n=8)

GroupMTTAIR(%)TRAF6expressionControl0.554±0.051—0.014±0.002LPS0.401±0.047**31.200.057±0.000**PCA0.516±0.04411.740.017±0.002PCA+LPS0.476±0.049△14.000.024±0.004△△

**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsLPS.

Figure 1. Distribution of TRAF6 protein in the HUVECs (×200).

图1HUVECs中TRAF6蛋白的分布

3 HUVECs胞内NF-κB p65、c-Jun及c-Fos蛋白的表达

Western blot结果显示，与对照组相比，LPS组中NF-κB p65、c-Jun和c-Fos的蛋白表达均明显增加(P<0.01)；PCA+LPS组3种蛋白的表达则明显低于LPS组(P<0.01)，见图2。

4 PCA对HUVECs损伤时TF mRNA及蛋白表达的影响

qPCR检测结果可见，与对照组比较，LPS组TF的mRNA表达明显增加(P<0.01)；PCA组与对照组比较差异无统计学显著性；PCA+LPS组与LPS组比较，TF的mRNA表达明显减少(P<0.01)，见图3。Western blot检测TF蛋白的结果可见，与对照组相比，LPS组TF蛋白表达明显增加(P<0.01),而PCA组的比值无显著变化；PCA+LPS组蛋白表达则明显低于LPS组(P<0.01)，见图4。ELISA法检测细胞培养上清液中TF表达量可见，与对照组相比，LPS组TF的表达量明显增加(P<0.01)，而PCA组的值无显著变化；PCA+LPS组TF值则明显低于LPS组(P<0.01)，见图5。

Figure 2. The results of Western blot for protein expression of NF-κB p65, c-Jun and c-Fos. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsLPS.

图2NF-κBp65、c-Jun和c-Fos蛋白的Westernblot结果

Figure 3. The effect of PCA on the mRNA expression of TF in the HUVECs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsLPS.

图3PCA对HUVECs损伤时TFmRNA表达的影响

讨 论

生理状态下VECs不表达TF，但病变的血管内皮细胞高表达TF，引起血液高凝状态，导致病理性血栓形成[11]。不同刺激诱导内皮细胞TF的表达涉及不同的信号。可以引起内皮细胞表达TF的刺激因子包括细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-8)、LPS、生长因子(VEGF、FGF)[12]和缺氧等。现已知涉及到诱导TF表达的信号转导关键酶有很多，它们介导相同或不同的信号途径，但不管如何都认为p44/42 MAPK、p38 MAPK以及转录因子Egr-1、NF-κB、AP-1的激活对诱导TF是必需的[13]。

Figure 4. The result of Western blot for protein expression of TF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsLPS.

图4TF蛋白的Westernblot结果

Figure 5. PCA reduces the TF expression in HUVECs culture supernatants. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsLPS.

图5PCA减少LPS诱导的HUVECs培养上清中TF表达

本实验室将PCA用于心血管疾病的研究，证实了PCA可改善LPS引起的大鼠心肌损伤，抑制大鼠微血栓的形成,对血栓性疾病发生发展的重要环节——VECs损伤有抑制作用，减少损伤的VECs合成分泌TF[14]。这些实验提示了PCA可抑制VECs分泌TF，发挥抗凝作用，但具体如何抑制TF的合成分泌机制还不明确。实验通过MTT法检测发现PCA+LPS实验组细胞活性明显大于LPS组，可见PCA对HUVECs具有一定的保护作用。TF的表达是通过细胞内的TRAF6泛素化后激活核转录因子诱导的。TRAF6是细胞内多功能的信号转导分子，是激活NF-κB通路和MAPK信号通路(TRAF6/JNK/AP-1途径)的交叉点[15]。NF-κB和AP-1是细胞中普遍存在的转录因子，介导细胞内信息传递，可调控多种细胞因子的基因表达。细胞处于静息状态时，这2种转录因子活性极低或被抑制，但当受到外界刺激时(如TNF-α、IL-1、LPS等)，它们就会迅速被激活，启动基因的转录[16-17]。本实验显示PCA+LPS实验组TRAF6 平均光密度明显小于LPS组，TRAF6活化被抑制，NF-κB p65、c-Jun和c-Fos 3种蛋白的表达也被抑制，同时TF mRNA、蛋白在细胞培养上清液中含量均明显少于LPS组。蛋白的表达主要是靠基因调控[18]。因此得出，PCA可减轻LPS引起的HUVECs损伤，是通过抑制TRAF6、NF-κB及AP-1核转录因子的活化来抑制TF基因的表达，从而减少组织因子的释放。

[参 考 文 献]

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