正交设计法优选生血康颗粒的提取工艺

2018-05-17王俊杰张玲昂解放军第152医院药械科河南平顶山467000

中国医院用药评价与分析 2018年4期

王俊杰，刘弘，张玲昂(解放军第152医院药械科，河南平顶山 467000)

生血康颗粒由熟地黄、当归、黄芪、何首乌及枸杞子等8味中药组成，是解放军第152医院名老中医临床协定处方，具有益气生血、健脾固本之功效。临床主要用于神倦乏力、面色萎黄、贫血及放化疗等多种原因引起的白细胞、血小板计数降低等，疗效显著。该制剂由汤剂发展而来，关于其工艺研究与质量标准的报道少见。为保证制剂质量稳定可靠，现对生血康颗粒提取工艺进行研究，根据处方中药物各组分的理化性质及药效特点，采用正交设计法，对处方中当归、黄芪及白术进行醇提，其药渣与其他药材进行水提，为该制剂的生产与开发提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-20MA二极管阵列检测器，AUW120D电子分析天平，岛津UV-2401PC紫外分光光度计，均来自日本岛津公司。

1.2 药品与试剂

处方中熟地、当归等药材来源于解放军第152中心医院中药房，经赵国景副主任药师鉴定，均符合《中华人民共和国药典》(2015年版)规定。阿魏酸对照品(批号：110703—201128)，二苯乙烯苷对照品(批号：110844—201109)，无水葡萄糖对照品(批号：111562—200807)，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱醇，水为娃哈哈纯净水，磷酸为分析醇。

2 方法与结果

2.1 阿魏酸的含量测定

2.1.1 色谱条件：色谱柱为Wondasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸(V∶V=20 ∶80)；流速为1.0 ml/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μl；检测波长为316 nm[1-3]。

2.1.2 提取浓缩液的制备：称取1/10处方量的黄芪、当归、白术药材9份，按正交设计条件进行提取，合并提取液，滤过，减压浓缩至约100 ml，离心，上清液转移至100 ml容量瓶中，定容，备用。

2.1.3 对照品溶液的制备：精密称取阿魏酸对照品适量，置于50 ml棕色容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，制成1 ml含202.6 μg的对照品贮备液，摇匀，精密量取上述溶液5 ml，置于25 ml容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 供试品溶液的制备：精密量取“2.1.2”项下浓缩液10 ml置于25 ml容量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，离心，上清液用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.5 线性关系考察：精密量取对照品储备液1、2、4、8及16 ml置于25 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，再分别精密吸取上述溶液各10 μl，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。以阿魏酸进样量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，线性回归方程为Y=6 563 872X-410 029，r=0.999 9，阿魏酸在0.081～1.297 μg范围内线性关系良好。

2.2 二苯乙烯苷的含量测定

2.2.1 色谱条件：色谱柱为Wondasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.05%磷酸(V∶V=16 ∶84)；流速为1.0 ml/min；柱温为35 ℃；进样量为10 μl；检测波长为320 nm[4-5]。

2.2.2 提取浓缩液的制备：取1/10处方量的药材与当归、黄芪及白术醇提后的药渣共煎，合并提取液，滤过，滤液浓缩至适量转移至100 ml容量瓶中，定容，备用。

2.2.3 对照品溶液的制备：精密称取二苯乙烯苷对照品适量置于50 ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成1 ml含285.5 μg的对照品贮备液，摇匀，精密量取上述溶液1 ml置于10 ml容量瓶中，用稀乙醇定容，摇匀，即得。

2.2.4 供试品溶液的制备：精密量取“2.2.2”项下浓缩液1 ml置于50 ml容量瓶中，稀乙醇定容，摇匀，离心，上清液用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.5 线性关系考察：精密量取对照品储备液1、2、4、8及16 ml分别置于25 ml容量瓶中，加稀乙醇定容至刻度，再分别精密吸取上述溶液各10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析。以二苯乙烯苷进样量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，其线性回归方程为Y=1 313 789X-36 226，r=0.999 9，二苯乙烯苷在0.114～1.827 μg范围内线性关系良好。

2.3 多糖的含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，置于100 ml容量瓶中，加水适量溶解，定容，摇匀，制得每1 ml中含无水葡萄糖0.121 6 mg的对照品溶液。

2.3.2 标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 ml，分别置于具塞试管中，加水补至2.0 ml，分别精密加入5%苯酚溶液1 ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5 ml，摇匀，放置10 min，置于40 ℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温(25 ℃)。精密量取水2.0 ml，精密加入5%苯酚溶液1 ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5 ml，摇匀，放置10 min，置于40 ℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，作为空白溶液。采用紫外-可见分光光度法在490 nm的波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为A=8.888 9C-0.014 6，r=0.999 8，线性范围是3.04～15.20 μg/ml。

2.3.3 含量测定：精密量取“2.2.2”项下浓缩液1 ml，加水至5 ml，加95%乙醇使含醇量至80%，边加边搅拌，离心，弃去上清液，残渣加适量水溶解，定容至50 ml容量瓶中，滤过，精密量取续滤液1 ml置于10 ml容量瓶中，定容，再精密量取1 ml，置于具塞试管中，加水1.0 ml，分别精密加入5%苯酚溶液1 ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5 ml，摇匀，放置10 min，置于40 ℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温。精密量取水2.0 ml，精密加入5%苯酚溶液1 ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5 ml，摇匀，放置10 min，置于40 ℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，作为空白溶液。采用紫外-可见分光光度法在490 nm的波长处测定吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液中含葡萄糖的质量(mg)。

2.4 正交设计法优选提取工艺

2.4.1 醇提工艺正交设计：生血康颗粒中黄芪、当归、白术的主要有效成分易溶于乙醇，故以一定浓度乙醇作为溶媒。结合相关文献[6-9]和预试验结果，浸泡时间(预浸泡0.5 h)对提取影响较小，乙醇量、乙醇浓度、提取时间及提取次数对提取影响较大。采用L9(34)正交表，以阿魏酸转移率和干膏得率[转移率=提取液中指标成分含量(mg)/药材中指标成分含量(mg)×100%，干膏得率=干膏质量(g)/药材总质量(g)×100%]为考察指标，乙醇量、乙醇浓度、提取时间及提取次数为因素，因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 醇提工艺因素水平表Tab 1 Factor levels of ethanol extraction process

表2 醇提正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal test of ethanol extraction process

注：综合评分=阿魏酸转移率/最大阿魏酸转移率×0.8×100+干膏得率/最大干膏得率×0.2×100

Note: comprehensive evaluation=transfer rate of ferulic acid/maximum transfer rate of ferulic acid×0.8×100+ obtain rate of dried paste/ maximum obtain rate of dried paste×0.2×100

表3 醇提工艺方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis of ethanol extraction process

注：F0.05(2,2)=19.0

结果表明，各因素影响程度依次是D>A>B>C，最佳提取方案为A3B3C3D3；方差分析结果表明，提取次数(D)有显著性影响，乙醇用量对结果影响最小，乙醇浓度60%与70%相差不大，基于节约时间与降低能耗考虑，最终确定A2B2C2D3为最佳提取工艺，即以8倍量60%乙醇提取回流3次，每次1.5 h。

2.4.2 醇提工艺验证实验：按最佳提取工艺条件提取处方量的黄芪、当归和白术3味药材，共3份，测定阿魏酸转移率和干膏得率，结果显示，阿魏酸平均转移率为94.6%，RSD为1.76%；干膏得率为26.2%，RSD为1.83%(n=3)，表明最佳提取工艺科学、合理，能保证提取质量。

2.4.3 水提工艺正交设计：根据生血康颗粒中熟地黄、枸杞子及何首乌等药材所含成分的性质和特点[10-13]，采用加水回流进行提取。取“2.2.2”项下浓缩液,以二苯乙烯苷转移率和干膏得率、总多糖含量为考察指标，以加水量、提取时间和提取次数为考察因素，采用L9(34)正交表进行试验，因素水平见表4，正交设计结果见表5，方差分析见表6。

表4 水提工艺因素水平表Tab 4 Factor levels of aqueous extraction process

表5 水提工艺正交试验结果Tab 5 Results of orthogonal test of aqueous extraction process

注：综合评分=二苯乙烯苷转移率/最大二苯乙烯苷转移率×0.5×100+总多糖含量/最大总多糖含量×0.3×100+干膏得率/最大干膏得率×0.2×100

Note: comprehensive evaluation=transfer rate of stibene glucoside/maximum transfer rate of stibene glucoside×0.5×100+ content of total polysaccharide/ maximum content of total polysaccharide×0.3×100+ obtain rate of dried paste/ maximum obtain rate of dried paste×0.2×100

表6 水提工艺方差分析结果Tab 6 Results of variance analysis of aqueous extraction process

注：F0.05(2,2)=19.0

结果表明，各因素影响程度依次是C>A>B，最佳提取方案为A1B3C3；方差分析结果表明提取次数(C)有非常显著性，加水量有(A)有显著性，提取时间(B)无显著性，综合3种因素对二苯乙烯苷转移率、总多糖含量和干膏得率的影响，确定A1B3C3为最佳提取工艺；因素B从直观分析看出，提取时间增加但总的指标并未显著增加，从节约能耗和保护环境考虑，最终确定A1B1C3为最佳提取工艺，即以12倍量水提取回流3次，每次1.0 h。

2.4.4 水提工艺验证试验：按优化的水提工艺条件提取所得3份样品，测定二苯乙烯苷转移率、总多糖含量和干膏得率。验证实验结果显示，二苯乙烯苷转移率为87.5%，RSD为1.28%；总多糖含量为27.3 mg/ml，RSD为1.32%；干膏得率为31.4%，RSD为1.34%(n=3)，表明最佳水提工艺重现性好，工艺稳定。

3 讨论

生血康颗粒方中当归、熟地黄共为君药，当归甘辛、性温[14]，补血活血，其主要成分为阿魏酸；熟地性甘、微温[15]，可补血滋阴，益精填髓，多糖为其补血作用的有效成分；何首乌苦甘涩、微温，补肝肾，益精血；熟地黄、何首乌补阴，何首乌为阴中之阳药，专入肝经以为益血祛风之用，二苯乙烯苷为其主要成分。故选择阿魏酸、二苯乙烯苷、总多糖为主要指标优选工艺参数。

文献报道阿魏酸、二苯乙烯苷含量测定时流动相采用乙腈-磷酸溶液系统，通过预实验发现，该方法测得杂质峰对目标峰干扰较大，光谱分析显示目标峰不纯，通过不断调整比例，最终目标峰分离度好，基线平稳。通过二苯乙烯苷结构分析可知：在苯环的2、3位是邻位酚羟基，易于脱氢形成分子内氢键。且酸性、碱性、高温及光线等因素促使苷元发生化学变化，结合正交试验结果得出，水提工艺不宜长时间加热，可进一步考察提取时间对提取效果的影响。

综上所述，醇提工艺为8倍量60%乙醇提取回流3次，每次1.5 h；水提工艺为12倍量水提取回流3次，每次1.0 h，该工艺科学、稳定并可靠。但本研究仅对工艺进行了初步研究，下一步应对其制粒工艺及质量标准进行深入研究，为制剂开发申报提供数据。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：133.

[2]陈君，何婧，李志浩.HPLC法测定当归黄精膏中阿魏酸的含量[J].中医药导报，2015，21(1)：53-55.

[3]钟露苗，彭艳梅.醒脑通络片中阿魏酸含量测定发法学研究[J].中南药学，2010，8(2)：135-138.

[4]李洪泽，齐骁勇，韩风雨，等.HPLC法测定六味首乌颗粒中二苯乙烯苷的含量[J].中国现代药物应用，2015，9(2)：219-221.

[5]周涛，江维克.HPLC法测定益视口服液中二苯乙烯苷的含量[J].中国药房，2009，20(6)：450-451.

[6]靳瑞婷，陶永华，李雪峰，等.芪白平肺颗粒中人参和黄芪提取工艺的优化[J].中成药，2016，38(4)：795-800.

[7]蔡璇.响应面法优化当归总黄酮提取工艺的研究[J].食品研究与开发，2016，37(3)：100-104.

[8]饶丽明，朱岳鑫，吴立蓉.白术总黄酮提取工艺研究[J].中国处方药，2016，14(6)：36-38.

[9]戚志华，徐媛，张琰，等.归辛胶囊中当归，川芎提取工艺的正交试验[J].中国医院药学杂志，2010，30(21)：1811-1813.

[10] 雷鹏，刘韶，李新中，等.正交试验法优选熟地黄提取工艺[J].中国医院药学杂志，2006，26(12)：1485-1487.