H 2S对大鼠心肌肥大与miRNA-133a和Ca2+／CaN／NFATc4信号通路的影响*

吴 扬，郭媛媛，张元媛，张 宜

（南通大学航海医学研究所，江苏南通226019）

近些年来，科学家发现生物体内可合成内源性H2S，它作为一种新型的调节因子和信号传递分子，在神经、心血管等系统中发挥重要的生理调节作用，因而被称之为继NO和CO之后发现的第三种气体信使分 子［1，2］。胱硫 醚-γ-裂 解 酶 （cystathionineγlyase，CSE）是心血管系统中生成内源性H2S的主要合成酶［3］。近年来，H2S作为一种重要的气体信号分子，已成为心血管疾病研究的新靶标。研究［4，5］表明，miR-133a是心肌肥大重要的负性调控因子。CaN和 NFATc4已被证实是miR-133a的下游靶基因。H2S是否可能通过上调miR-133a表达，进而抑制其下游Ca2+／CaN／NFATc4信号通路的激活，参与调节心肌肥大发生发展过程，目前尚不十分清楚。

本研究应用异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）建立心肌细胞肥大模型，观察心肌细胞肥大时CSE／H2S体系的变化，明确内源性H2S在心肌细胞肥大中的作用，探讨H2S对心肌细胞肥大的调控作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

炔丙基甘氨酸（propargylglycine，PAG）（Sigma，USA），rabbit anti-CaN、rabbit anti-NFATc4 （CST，USA），Lipofectamine 2000、Fluo-4／AM（Invitrogen，USA），miRNA-133a antagomir、miRNA-133a-antagmir-NC（吉玛生物技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 心肌细胞培养 新生1～3 d SD大鼠（南通大学动物中心提供），取心脏置D-Hanks液中，将心室肌切碎约1 mm3，加入10 ml 0.125%胰酶搅拌消化。弃上清，细胞移至15%小牛血清DMEM培养液中孵育。将细胞接种于100 mm规格的无菌培养皿中，于5%CO2、饱和湿度的37℃培养箱中放置2 h。孵育后，加入Brdu使其终浓度为0.1 mmol／L。台盼蓝染色观察细胞存活率，细胞计数后接种于6孔培养板。培养48 h后，换无血清DMEM培养基，24 h后加入干预因素［6］。

1.2.2 心肌细胞表面积测定 心肌细胞加ISO持续作用48 h后，在相差显微镜下拍照，每孔取10个视野，每个视野约20个细胞。采用Leica图像分析系统，标尺测量细胞表面积，取平均值。

1.2.3 心肌细胞蛋白含量测定 将6孔板贴壁培养的心肌细胞用胰蛋白酶处理使其脱落悬浮，用细胞计数仪测定细胞数，一个样本的细胞数约为（8～9）×105cells。用BCA法测定心肌细胞总蛋白含量。

1.2.4 RNA提取和qRT-PCR 样品总RNA提取采用TRIzol试剂盒，按说明书步骤提取总RNA。逆转录和 qRT-PCR实验按说明书步骤进行。BNP，β-MHC，CSE，CaN，miRNA-133a，GAPDH引物（上海生工合成）序列如下：BNP上游引物 5’-CAGCTCTCAAAGGACCAAGG-3’，BNP下游引物 5’-CACTGTGGCAAGTTTGTGCT-3’；β-MHC上游引物 5’-AACCTGTCCAAGTTCCGCAAGGTG-3’，β-MHC下游引物 5’-GAGCTGGGTAGCACAAGAGCTACT-3’；CSE上游引物5’-TCCGATGACCTCAACGAAC-3’，CSE下游引物 5’-CGGTAGCCCAGGATAAATAA-3’；CaN上游引物 5’-CCACAGGGATGTTGCCTAGTG-3’，CaN下游引物 5’-GTCCCGTGGTTCTCAGTGGTA-3’；miRNA-133a上游引物 5’-ATGGTTCGTGGGTTTGGTCCCCTTCAACC-3’，miRNA-133a下游引物 5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH上游引物 5’-TCTACATGTTCCAGTATGA CTC-3’，GAPDH下游引物 5’-ACTCCACGACATAC TCAGCACC-3’。将配制的溶液置于 qRT-PCR仪中进行扩增，退火温度60℃，15 s。根据目的基因与内参基因的Ct值求得各样本目的基因表达水平。

1.2.5 Western blot检测 CaN、NFATc4蛋白的表达

提取各组心肌细胞总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，并调整上样量为30μl。10%SDS-PAGE分离，PVDF膜印迹。室温封闭2 h，加入一抗稀释液（anti-CaN抗体 1∶1 000、anti-NFATc4抗体 1∶1 000、anti-GAPDH抗体 1∶5 000、anti-PCNA抗体 1∶1 000稀释），4℃过夜，然后加入辣根过氧化物酶HRP标记的二抗孵育2 h。ECL化学发光显色，X光片显影、定影。将胶片进行扫描或拍照，美国 UVP公司GDS8000摄取图像，Image J分析软件对条带进行定量分析。

1.2.6 心肌细胞转染 每孔取1.25μl寡聚物稀释至50μl Opti MEM培养液；取 1.5μl lipofectamine 2 000稀释到50μl Opti MEM培养液，加至已稀释的寡聚物中孵育。弃培养基，加入400μl Opti-MEM，加至心肌细胞中，置培养箱培养24 h，换正常培养基，培养24 h后用于检测。用于转染的miRNA-133a抑制剂（miRNA-133a antagomir）和 miRNA-133a抑制剂的阴性对照（miRNA-133a antagomir-NC）。

1.2.7 Elisa法检测心肌细胞内H2S含量 将心肌细胞消化后收集，加入PBS稀释细胞悬液，细胞密度达到1×106cells／ml左右。反复冻融，使细胞破裂。4℃，2 000～3 000 r／min离心20 min，收集上清。BCA试剂盒测定各组蛋白浓度，然后进行心肌细胞内H2S含量测定。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔吸光度（OD值）。

1.2.8 激光共聚焦显微镜检测心肌细胞钙离子浓度 心肌细胞加入 1 ml PBS（含 5μl Fluo-4／AM），37℃培养箱中避光染色30 min。用PBS洗去荧光染料，将培养板置激光共聚焦显微镜下，对心肌细胞进行扫描，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。将测取的钙荧光图像存入计算机，荧光强度值由Leica激光共聚焦显微镜自带软件Fluoview自动分析。

1.3 统计学分析

实验数据以均数±标准差（±s）表示。应用GraphPad Prism5软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 H2S对心肌细胞肥大的负性调控作用

在用 10μmol／L ISO诱导心肌细胞肥大前30 min，分别应用100μmol／L NaHS增加细胞内 H2S含量，或应用2 mmol／L PAG降低细胞内H2S含量，观察对心肌细胞肥大的影响。实验分组：（1）对照组、（2）ISO组、（3）NaHS组、（4）NaHS+ISO组、（5）PAG组、（6）PAG+ISO组。结果显示：与对照组相比，ISO组或PAG组CSE mRNA表达均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与ISO组比较，NaHS+ISO组CSEmRNA表达显著增加（P＜0.01），PAG+ISO组则进一步降低（P＜0.05）。NaHS组与对照组相比，无明显差异（图 1A）。

与对照组相比，ISO组心肌细胞内H2S含量降低（P＜0.01），NaHS组 H2S含量增加（P＜0.01），PAG组细胞内H2S含量降低（P＜0.01）。与ISO组相比，NaHS+ISO组 H2S含量增加（P＜0.01），而PAG+ISO组则进一步降低（P＜0.01，图 1B）。

Fig.1 Effects of NaHSand PAGon the level of CSE／H2Sin the ISO-induced cardiomyotytes hypertrophy（±s，n＝4）

与对照组相比，ISO组心肌细胞表面积、蛋白含量、BNP和β-MHC mRNA表达均明显增加（P＜0.01）。NaHS+ISO组与ISO组相比，心肌细胞表面积、蛋白含量、BNP和β-MHCmRNA表达均明显减少（P＜0.05，P＜0.01）。PAG+ISO组与 ISO组相比，心肌细胞表面积、蛋白含量、β-MHC和BNPmRNA表达水平均增加（P＜0.05，P＜0.01）。NaHS或 PAG组与对照组相比，均未见明显差异（图2）。

Fig.2 Effects of negative regulation of H2Son cardiomyocyte hypertrophy（±s，n＝4）

2.2 H2S对心肌细胞肥大抑制作用与miRNA-133a及Ca2+／CaN／NFATc4通路的关系

2.2.1 上调或下调 H2S含量对心肌细胞 miRNA-133a及Ca2+／CaN／NFATc4通路的影响 分别应用NaHS或PAG上调或下调心肌细胞内H2S含量，观察对心肌细胞 miR-133a及 Ca2+／CaN／NFATc4信号通路相关因子的影响。实验分组同前。结果显示：与对照组相比，ISO组miR-133a mRNA表达降低、心肌细胞内Ca2+浓度增加、CaN mRNA和蛋白表达均明显增加、NFATc4核转位增强、NFATc4胞浆蛋白表达减少而核蛋白表达增加（P＜0.05，P＜0.01）。NaHS预处理组明显逆转ISO引起的上述效应。相反，PAG预处理组则进一步增强ISO引起的上述效应（图 3）。

Fig.3 Effects of NaHSor PAG on the miRNA-133a and Ca2+／CaN／NFATc4 pathway in the ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy（±s，n＝4）

2.2.2 Antagomir-133a干扰对 H2S抑制心肌细胞肥大及miRNA-133a介导的 Ca2+／CaN／NFATc4信号通路的影响 应用miRNA-133a抑制剂antagomir-133a干扰，观察对心肌细胞肥大及Ca2+／CaN／NFATc4通路的影响。首先，检测应用lipofectamine 2 000将antagomir-133a转染至心肌细胞的转染效率。结果显示，将antagomir-133a转染细胞后，可显著降低miRNA-133a的表达水平，其干扰率达95%以上，表明转染效果很好。实验分组：（1）对照组，（2）ISO组，（3）NaHS组，（4）NaHS+ISO组，（5）antagomir-133a+NaHS+ISO组，（6）NC+NaHS+ISO组。

结果显示，与 NC+NaHS+ISO组相比，antagomir-133a+NaHS+ISO组心肌细胞表面积、蛋白含量、BNP和β-MHC mRNA表达增加（P＜0.05）。NaHS+ISO组与NC+NaHS+ISO组相比，差异无显著性（图 4A、4B、4C、4D）。

与对照组相比，ISO组miRNA-133a mRNA表达降低、细胞内Ca2+浓度明显增加、CaN mRNA和蛋白表达均增加、NFATc4核转位明显增强、NFATc4胞浆蛋白表达减少而胞核蛋白表达增加（P＜0.01）。与ISO组相比，NaHS+ISO组miR-133a mRNA表达升高、细胞内Ca2+浓度明显减少、CaN mRNA和蛋白表达均降低、NFATc4核转位减弱、NFATc4胞浆蛋白表达增加而胞核蛋白表达下降（P＜0.05，P＜0.01）；与NC+NaHS+ISO组相比，antagomir-133a+NaHS+ISO组miRNA-133a表达降低、细胞内Ca2+浓度有所增加、CaN mRNA和蛋白表达增加、NFATc4核转位增强、NFATc4胞浆蛋白表达减少而胞核蛋白表达增加（P＜0.05，P＜0.01）。NaHS+ISO组与 NC+NaHS+ISO组相比，无统计学差异（图 4E、4F、4G、4H、4I）。

Fig.4 Effects of antagomir-133a interference on cardiomyocyte hypertrophy and miR-133a-mediated Ca2+／CaN／NFATc4 signal pathway（±s，n＝4）

3 讨论

本课题组以往的实验表明［7］，应用 10μmol／L ISO诱导心肌细胞肥大，可引起心肌细胞肥大的主要指标，即心肌细胞形态和细胞表面积均明显增大，细胞蛋白含量、以及心肌肥大标志基因BNP、β-MHC mRNA表达均增高，表明应用ISO能够成功构建心肌细胞肥大模型。

为了探讨H2S在心肌肥大中的作用，本研究应用ISO诱导心肌细胞肥大，观察心肌细胞内CSE／H2S表达变化。结果表明，ISO诱导的心肌细胞肥大，CSE／H2S水平明显下降。此外，应用 H2S供体NaHS上调细胞内H2S含量，或应用CSE特异性抑制剂PAG降低细胞内H2S含量，观察对心肌细胞肥大的影响。结果发现，NaHS预处理能明显抑制ISO诱导的心肌细胞表面积、蛋白含量以及 BNP、β-MHC mRNA表达水平的增加，提示NaHS能够抑制心肌细胞肥大。相反，应用PAG预处理减少内源性H2S生成，则增强ISO诱导的心肌细胞肥大的效应。

信号转导在心肌肥大的发生发展中是一个中心环节。有文献报道［8］，过表达 CaN或 NFATc4的转基因小鼠出生后可出现与人类心肌肥大相似的病理变化，提示心肌细胞内可能存在一条致心肌肥大的信号转导通路，即CaN／NFATc4信号通路。CaN是一种受Ca2+调控的丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶。在细胞信号传递的过程中，CaN被Ca2+激活后使胞浆中靶蛋白NFATc4脱磷酸化后入核，继而和核内转录因子GATA4相互作用，激活心肌肥大相关基因表达从而诱导心肌细胞肥大。已有研究［4］证实，CaN是miR-133的下游靶基因。当心肌肥大时，miR-133表达降低、CaN的表达增加且活性增强；而当上调miR-133的表达或抑制CaN的表达则能够对抗心肌肥大。综上分析，我们推测H2S抑制心肌肥大作用可能与 miR-133a介导的 Ca2+／CaN／NFATc4通路相关。为了验证两者的关系，本研究分别应用NaHS或PAG预处理增加或减少心肌细胞内H2S的水平，观察对心肌细胞中 miR-133a表达、以及对 Ca2+／CaN／NFATc4信号通路的影响。结果发现，ISO刺激能使心肌细胞miR-133a表达降低、细胞内Ca2+浓度增加、CaN mRNA及蛋白表达增加、NFATc4核蛋白表达增加及核转位增强。应用NaHS增加细胞内H2S水平，可明显抑制ISO诱导的上述效应；而应用PAG减少心肌细胞内H2S的生成，则明显增强ISO诱导的肥大作用。

为了进一步探讨H2S抑制心肌细胞肥大作用与miR-133a介导的 Ca2+／CaN／NFATc4信号通路的关系，本实验应用miR-133a抑制剂antagomir-133a干扰ISO诱导的心肌细胞，观察对心肌细胞肥大及Ca2+／CaN／NFATc4信号通路的影响。结果发现，antagomir-133a能进一步加强ISO诱导的心肌细胞肥大效应，并增加ISO诱导的心肌细胞内Ca2+浓度、CaN mRNA和蛋白表达及NFATc4胞核蛋白表达、增强NFATc4核转位。此外，antagomir-133a还能部分逆转H2S抑制心肌细胞肥大的作用。

综上所述，H2S可通过负性调控作用抑制心肌细胞肥大。心肌细胞肥大发生可能与CSE／H2S体系功能降低，内源性H2S合成减少有关。H2S负性调控心肌细胞肥大的作用可能与H2S上调miRNA-133a的表达，抑制其下游 Ca2+／CaN／NFATc4信号通路的激活有关。本研究进一步阐明H2S对心肌细胞肥大的调控作用及其机制，将有助于全面了解心肌肥大的病理机制，并为该疾病的防治提供新的思路和理论依据。

【参考文献】

［1］ Wang R.Physiological implications of hydrogen sulfide：A whiff exploration that blossomed［J］.Physiol Rev，2012，92（4）：791-896.

［2］ Chen JT，Gao J，Sun WM，et al.Involvement of exogenous H2Sin recovery of cardioprotection from ischemic post-conditioning via increase of autophagy in the aged hearts［J］.Int J Cardiol，2016，220（10）：681-692.

［3］ Predmore BL，Lefer DJ，Gojon G.Hydrogen sulfide in biochemistry and medicine［J］.Antioxid Redox Signal，2012，17（1）：119-140.

［4］ Chen C，Huo R，Wang N，et al.Reciprocal repression between microRNA-133 and calcineurin regulates cardiac hypertrophy：a novel mechanism for progressive cardiac hypertrophy［J］.Hypertension，2010，55（4）：946-952.

［5］ Small EM，Olson EN.Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology［J］.Nature，2011，469（7330）：336-342.

［6］ 吴 扬，耿 鹏，王玉琴，等.MicroRNA-1在心肌肥大中对L-型钙通道β2亚基的负性调控作用［J］.中国应用生理学杂志，2012，28（4）：304-308.

［7］ 吴 扬，王宝霞，郭媛媛，等.PPAR-α对心肌肥大负性调控作用及与 PI3K／Akt／mTOR通路的关系［J］.中国应用生理学杂志，2015，31（3）：284-288.

［8］ Wilkins BJ，Molkentin JD.Calcium-calcineurin signaling in the regulation of cardiac hypertrophy［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，322（4）：1178-1191.