不同强度运动训练对心肌凋亡途径微小RNA及其靶蛋白的影响*

赵永才，付近梅，高炳宏△

（1.上海体育学院，上海200438；2.江西省体育科学研究所，南昌330006）

凋亡是细胞发生的一种程序性死亡，由基因控制的细胞主动性死亡过程。凋亡在生长发育、预防有丝分裂组织癌变等生理过程中起积极作用，但过高水平凋亡却与心肌组织功能紊乱、心血管疾病发病密切相关。心肌细胞属于终末分化细胞，其凋亡的发生对心肌生理机能影响较大，虽然心肌细胞也存在微弱增殖能力，但效率过低，不足以弥补一些病理应激所引发的细胞流失［1］。因此寻求干预手段来减少、延缓心肌细胞凋亡成为研究热点。

线粒体调节内源性凋亡信号，各类应激可引发线粒体膜电位发生变化，改变线粒体膜Bcl-2的表达和定位，影响细胞色素 c释放和 caspase蛋白激活［2］；外源性凋亡途径中，Programmed cell death 4（PDCD4）分子在促凋亡发生中起关键作用。微小RNA（microRNAs，miRs）在心肌细胞内、外源凋亡途径中发挥作用，miR-1在心肌中特异性高表达，直接以Bcl-2 mRNA为靶目标，抑制其蛋白表达，一定程度发挥促凋亡的作用［3］。而 miR-21以 PDCD4 mRNA为靶目标，抑制其蛋白表达，发挥抗凋亡作用［4］。研究认为适当运动能够降低人群心血管应激所引发的死亡率［5］。动物研究也表明运动可减少高血压心肌细胞内外源凋亡信号强度［6］。运动训练干预心肌凋亡的过程中，相关miRs以及下游靶蛋白有何变化，目前报道较少。本文考察游泳训练对心肌miR-1、miR-21以及 Bcl-2、PDCD4、Bax蛋白的影响，讨论运动干预心肌凋亡的调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

21只雄性 2月龄 C57BL／6小鼠，平均体重为（17±1.8）g，分笼饲养。普通动物饲料自由取食、饮水。采用人工照明模拟昼夜节律，随机分3组（n＝7）：安静组（sedentary group，SE）、训练组 1（exercise training group 1，ET1），训练组 2（exercise training group 2，ET2）。

1.2 游泳运动安排及取材

小鼠先进行1周适应性游泳。实验正式开始，SE组不做运动干预；ET1组进行8周游泳运动训练，每周前5 d运动，每天1次，第1周30 min／count，以后每周每次再增加10 min，最后两周训练时间维持在90 min；ET2组前5周运动方案与ET1相同，后3周每天训练2次（早、晚各1次），每次训练时间和ET1相同。训练结束后，取小鼠心肌组织，一部分用于制作TUNEL检测切片，另一部分-80℃冷冻备用。

1.3 TUNEL凋亡检测方法

使用 TUNEL检测试剂盒（Promega公司）进行TUNEL凋亡检测：使用二甲苯2次脱蜡，梯度浓度酒精脱水，多聚甲醛固定；20μg／ml蛋白酶 k室温孵育，多聚甲醛固定；Equilibration Buffer室温平衡10 min，rTdT反应液 37℃孵育 60 min；3%H2O2室温封闭 10 min，加 Streptavidin HRP（1∶500 PBS稀释）；显色后封片。随机视野下计数总细胞和凋亡细胞，获取凋亡指数。

1.4 miRs检测

1.4.1 引物设计及miRs逆转录 Invitrogen公司提供RNA提取试剂盒，严格操作抽提总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，符合实验要求，然后采用miRs-Stem-Loop反转录引物合成 cDNA。Primer 5.0引物软件设计所需引物，依据检测目标（miR-1、miR-21和U6内参）的序列设计扩增引物（表1）。

1.4.2 RT-PCR反应 扩增反应包括如下各类试剂：提取的 cDNA 1μl，miRs上游引物 0.5μl，通用型miRs下游引物 0.5μl，Power SYBR Green PCR Master Mix 10μl（SYBR Green、DNA聚合酶、dNTP、Buffer），无核酸酶水8μl。完成共计40个反应循环，扩增温度如下：95℃变性 10 min；95℃15 s；60℃1 min。应用ABI 7900 PCR仪，指标有：熔解曲线、CT值及△CT值。miRs相对含量用 2-ΔΔCT公式计算。

Tab.1Primers of miR-1 and miR-21

1.5 Western blot检测蛋白的表达

利用Western blot技术检测目的蛋白相对表达量，先提取总蛋白，蛋白上样后电泳，使用PVDF膜将蛋白转印，4℃孵育过夜，Bcl-2、Bax和PDCD4一抗（Santa Cruz提供）稀释浓度均为 1∶1 000，GAPDH抗体稀释浓度为1∶10 000。凝胶成像系统获得目的蛋白灰度。经过数值转化，SE组均值为1，对比观察其它组表达。

1.6 统计分析

使用 PASW Statistics 18.0统计软件，One-way ANOVA统计方法分析数据，以均数±标准差（±s）表示数据。

2 结果

2.1 运动训练对心肌凋亡的影响

相比 SE组凋亡指数（2.26±0.55）%，ET1组凋亡指数 （2.41±0.56）%无显著变化，ET2组凋亡指数（1.45±0.39）%显著性下降（P＜0.01）；ET2组凋亡指数也显著低于 ET1组（P＜0.01）。

2.2 运动训练后心肌miR-1、miR-21表达结果

相比SE组、ET1组miR-1的下降趋势不明显，但 ET2组miR-1降低幅度达29%（P＜0.01）；ET1组miR-21表达呈现上升趋势，ET2组miR-21表达升高幅度大，具有显著性差异（P＜0.05，表 2）。

2.3 运动训练后心肌Bcl-2、PDCD4和Bax蛋白表达的变化

MiRs可抑制靶蛋白表达，通过免疫印迹法分别测定miR-1、miR-21的靶蛋白 Bcl-2和 PDCD4，另外Bax蛋白在线粒体途径凋亡信号中起促凋亡作用，一并检测。运动训练促进Bcl-2表达，ET1组和ET2组表达均显著性高于SE组，提高幅度分别达86%和98%（P＜0.01）；PDCD4蛋白表达未呈现显著性变化，相比SE组，ET1组和ET2组表达仅有降低趋势，无统计意义；Bax蛋白变化与Bcl-2相反，相比SE组，ET1组和ET2组表达均显著性降低，降幅分别达38%和 60% （P＜0.01，图1）。

Tab.2 Expressions of myocardial miR-1 and miR-21 after training（±s，n＝7）

Tab.2 Expressions of myocardial miR-1 and miR-21 after training（±s，n＝7）

SE：Sedentary group；ET1：Exercise group 1；ET2：Exercise group 2*P＜0.05，**P＜0.01 vs SE group

Group miR-1 miR-21 SE 1.47±0.22 1.22±0.10 ET1 1.38±0.15 1.27±0.24 ET2 1.05±0.19** 1.43±0.23*

Fig.1 Effects of exercise training on Bcl-2、PDCD4 and Bax levels

2.4 miRs和靶蛋白相关性及训练后Bcl-2／Bax的变化

对本次研究筛选的miRs和靶蛋白表达水平进行相关性分析。在不同负荷状态下，miR-1和Bcl-2呈现出显著的负相关（P＜0.05）；而本次研究miR-21和 PDCD4并没有呈现显著性负相关。另外对Bcl-2和Bax相对表达比值进行计算，Bcl-2和Bax分别代表内源性凋亡途径抗凋亡和促凋亡的信号蛋白，研究发现 ET1组 Bcl-2／Bax比值增加 2倍，ET2组增加接近4倍，都具有显著性差异（P＜0.01，图2）。

3 讨论

Fig.2 Correlation between miRs and miR-targeted protein and the Bcl-2／Bax ratio

心脏在经历各类不良应激时凋亡水平会增加，例如缺血／再灌注、心衰以及衰老，另一方面，各种原因引发的过高水平心肌凋亡又加剧心脏机能的衰退，是各类心脏病发病的病理基础［7］。因此寻求各类干预心肌凋亡的手段，提高心肌的抗凋亡能力、减少心肌细胞凋亡流失是目前应用基础研究的热点。目前认为运动具有心肌保护效应，尤其降低病理状态下凋亡效应更佳。例如高血压大鼠心肌凋亡水平相对较高，而运动训练能够降低高血压大鼠心肌凋亡指数，减少内外源途径促凋亡蛋白的表达［6］。高脂饮食可建立大鼠肥胖模型，肥胖大鼠血脂紊乱，心肌细胞凋亡水平升高，6周游泳训练能够降低肥胖大鼠心肌凋亡水平，认为与心肌抗氧化酶增加、一氧化氮合酶减少有关［8］。生理状态下运动训练是否能干预心肌凋亡，也有研究进行考察，但结论有异同。Siu等人［9］早期对成年健康大鼠进行8周跑台耐力训练，发现训练组大鼠心肌Bcl-2、HSP70和Mn-SOD显著提高，认为跑台训练可提高生理水平心肌细胞抗凋亡基因表达，减少心肌凋亡流失。而来自Kwak等人［10］的研究认为游泳训练可明显降低衰老大鼠心肌凋亡水平，但对成年大鼠心肌凋亡影响不明显。目前认为运动保护心肌效应主要与心肌线粒体适应有关，运动可增加线粒体抗氧化物质储备，在氧化应激下可减少线粒体细胞色素C释放，减少心肌凋亡水平［5］。本实验表明生理状态下，本次ET2组中等强度负荷训练有效延缓小鼠心肌凋亡，对心肌具有一定保护效应。

miRs属于约22nt长非编码RNA，可与靶蛋白mRNA结合，抑制蛋白翻译表达或者降解 mRNA，miRs参与到心脏功能的调节，包括心肌生长、电传导、心肌收缩和凋亡等过程［11］，其中 miR-1和 miR-21明显调节心肌凋亡。研究［3］认为miR-1特异性在心肌中高表达，可以通过抑制下游靶蛋白调节心肌细胞凋亡，miR-1直接以Bcl-2为靶目标，抑制Bcl-2 mRNA翻译表达控制心肌凋亡水平。本次研究发现ET2组运动训练显著降低心肌miR-1表达，但ET1组miR-1表达降低无统计意义。与miR-1变化相反，两个训练组Bcl-2表达均显著性提高，表明miR-1下降可能有利于Bcl-2生成表达，这种效应在ET2组体现更明显。对miR-1和Bcl-2进行相关性分析，发现两者呈显著性负相关。以上表明miR-1和Bcl-2变化对运动训练的适应性变化可能是运动训练减缓心肌凋亡的机制之一，尤其ET2组中等负荷强度运动训练可能通过miR-1和Bcl-2的变化延缓心肌凋亡。相对而言，ET1组小强度耐力训练对miR-1和Bcl-2影响相对较小。

MiR-21在心肌中表达比较丰富，目前发现其在凋亡调节中起关键作用，心梗模型过表达miR-21能够明显降低细胞凋亡水平，并减少心梗区域面积并改善左心室重塑水平［12］。另一项研究［4］证实 miR-21能够直接结合PDCD4 mRNA，靶向抑制其表达，对抗凋亡。本次研究发现ET1组miR-21无明显变化，ET2组miR-21表达显著提高，而ET1、ET2组PDCD4蛋白表达均无显著性变化，仅有下降趋势，表明PDCD4蛋白对本次研究两种运动负荷不敏感。另外也并未发现miR-21和PDCD4有显著负相关。有其它研究［13］发现miR-21和PDCD4在不同心肌缺血预适应模型中变化缺乏规律，无相关性，说明miR-21和PDCD4调节比较复杂，体内实验中PDCD4可能受更多其它因素调节，训练对其干预不明显。总体上尽管ET2组训练负荷提高miR-21表达，但PDCD4对训练不敏感，miR-21和PDCD4变化特点与ET2组凋亡指数下降不吻合，可能不参与运动干预心肌凋亡的分子调节中。本研究认为miR-1及靶蛋白Bcl-2对训练的适应变化可能参与到运动保护心肌效应的分子调节通路，但miR-21和靶蛋白PDCD4变化并不参与此调节通路。值得关注的是基础研究发现miR-21具有心肌保护效应，而且其靶蛋白众多，还包括FasL、PTEN等［14］，miR-21是否通过抑制其它靶蛋白参与运动保护心肌效应还有待考察。

本次研究对Bax也进行测定，对比Bcl-2／Bax比值对运动训练的适应情况，在内源性凋亡途径中，Bcl-2起抗凋亡的作用，而Bax代表促凋亡的因子，两者比值变化一定程度上反映凋亡信号的转变。本次研究发现两种训练负荷均显著提升Bcl-2／Bax比值，表明两种训练负荷均能提高抗凋亡的信号强度，结合两个训练组凋亡指数，相对而言，只有ET2组中等负荷强度的运动训练能够显著降低心肌凋亡水平。

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