模拟100 m氦氮氧常规潜水对家兔氧化应激和炎性反应的影响*

李洋洋，石 路，张延猛，肖婵娟，刘洪涛

（1.上海交通大学海洋水下工程科学研究院有限公司，2.上海交通大学海洋水下工程科学研究院，3.上海交通大学-千叶大学国际合作研究中心，上海200231）

潜水时，随着周围压力的增加，氧分压和氮分压都会随之增加。一旦超过氮分压的耐受限度（一般为4.8～5.6 ATA）人就会出现视听觉延迟、即刻记忆受损等“氮麻醉”现象；而超过氧的耐受限度（一般为3 ATA）则会出现急性氧中毒、氧惊厥等症状。可见空气对于大深度的安全潜水并非理想气体［1］。我国相关标准规定空气潜水的深度限定在60 m。氦氧潜水（heliox diving）虽然可以下潜的比较深，但“氦语音”和高压神经综合征（high pressure nervous syndrome，HPNS）是其主要缺点［2］。

氦氮氧三元气（Trimix）潜水是国外发展的潜水新技术，可以弥补空气潜水的不足：氦气的麻醉作用比氮小，呼吸阻力也小，故能提高机体对高压的耐受限度，可以根据下潜深度和机体耐受范围灵活调整氮、氧分压，从而在克服空气潜水“氮麻醉”和“氧中毒”的同时下潜的更深［3，4］。Rostain等系统地概括了动物对高气压的不同生理效应，随着压力的升高，配制不同浓度的Trimix可以预防不同程度的HPNS的发生［5］。Bennett等亦证实在氦氧混合气中加入适量的氮气可以使人对高气压耐受限度可安全延伸至6.96 Mpa［6］。我国目前还没有大深度 Trimix常规潜水技术的相关系统性研究。因此，明确Trimix常规潜水对机体生理、生化功能可能的影响和机制就十分迫切。本实验旨在通过模拟家兔100 m Trimix常规潜水，探讨100 m Trimix潜水对家兔血清氧化／抗氧化指标、组织炎性因子和湿干比的影响，为今后开展人体实潜提供理论依据和科学支持。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康雄性家兔16只，体重2～3 kg。将动物随机分为两组（n＝8）：空白组不进行模拟潜水；模拟潜水组按实验设计的加减压方案进行模拟潜水。

1.2 实验设备及模拟潜水方案

高、低压两用动物舱，舱容0.3 m3，模拟高气压最大为6 MPa。模拟家兔100 m Trimix潜水加减压方案：下潜速度为10 m／min，50 m以上家兔呼吸空气，50 m以下往舱内补入氦气使呼吸气成为Trimix，加压到 100 m时舱内气体为 Trimix 14.5／41.8（14.5%氧，41.8%氦，43.6%氮），在 100 m停留 30 min。减压上升速度为6 m／min，减压至45 m时将舱内Trimix置换为空气；减压至20 m时将舱内空气置换为富氧气体（enriched air nitrox，EAN）（50%氧-50%氮）；减压至6 m时将舱内EAN置换为纯氧（≥95%）。高压暴露期间持续通风，并于舱底放置钠石灰以吸收家兔呼出的的CO2，暴露过程中舱内温度保持在 22℃～28℃。

1.3 检测指标

1.3.1 血清氧化／抗氧化指标 潜水前采集家兔动脉血2 ml，家兔安静30 min后进舱模拟潜水，模拟潜水减压结束出舱后即可再采集家兔动脉血2 ml。常温下离心（4 000 r／min，15 min）分离血清，-20℃保存，Elisa法分析检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondiadehyde，MDA）和过氧化脂质（lipid peroxide，LPO）的表达水平。

1.3.2 组织炎性因子 分别取空白组和模拟潜水组家兔肺、脑组织，对炎性因子γ干扰素（interferongamma，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白介素 6（interleukin-6，IL-6）、白介素 8（interleukin-8，IL-8）、髓过氧化物酶活力（myeloperoxidase，MPO）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表达进行Elisa测试。

1.3.3 组织湿干比 分别取空白组和模拟潜水组家兔肺、脑组织，在冰生理盐水中漂洗去组织表面残血，用滤纸吸干组织表面，称湿重；放置80℃烤箱内连续烘烤72 h，称干重，计算组织湿干比。

Elisa试剂盒均购自安迪生物科技（上海）有限公司，严格按照Elisa说明书进行操作。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0统计软件分析处理，测定值均以均数±标准差（±s）表示。炎性因子和组织湿干比两组均数比较采用独立样本 t检验，氧化／抗氧化指标两组均数比较采用配对 t检验。

2 结果

2.1 氧化应激指标的变化

模拟100 m Trimix常规潜水后，家兔血清SOD和 GSH活性较潜水前明显降低（P＜0.01），CAT、MDA和LPO含量则较潜水前显著升高（P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on oxidative stress in rabbits（±s，n＝8）

Tab.1 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on oxidative stress in rabbits（±s，n＝8）

SOD：Superoxide dismutase；CAT：Catalase；GSH：Glutathione；MDA：Malondiadehyde；LPO：Lipid peroxide**P＜0.01 vs pre-diving group

Group SOD（U／L）CAT（U／L）GSH（ng／L）MDA（nmol／L） ）Pre-diving 105.28±2.95 0.68±0.02 357.05±9.59 16.43±0.88 3.75±0.25 Post-diving 92.62±5.22** 0.76±0.05** 312.17±9.24** 20.25±0.69** 4.84±0.25 LPO（μmol／L**

2.2 炎性反应指标的变化

模拟潜水后家兔肺组织中 IL-8、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MMP-9及MPO含量、活性均较空白组明显升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；模拟潜水后家兔肺组织湿干比较空白组均无显著变化（表 2）。模拟潜水后家兔脑组织中 IL-8、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MMP-9及MPO含量、活性均较空白组明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；模拟潜水后家兔脑组织湿干比较空白组均无显著变化（表3）。

Tab.2 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits brain tissue（±s，n＝8）

Tab.2 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits brain tissue（±s，n＝8）

IFN-γ：Interferon-gamma；TNF-α：Tumor necrosis factor-α；IL-6：Interleukin-6；IL-8：Interleukin-8；MPO：Myeloperoxidase；MMP-9：Matrix metalloproteinase-9*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact group

Group IFN-γ（ng／L）Wet／Dry ratio Intact 873.72±27.32 179.85±4.98 61.64±1.95 42.56±2.66 90.03±2.73 44.27±2.19 5.82±0.42 Diving 937.49±14.16**197.32±6.56**67.35±3.13**45.60±1.34*98.71±2.32**50.39±1.60**TNF-α（ng／L）IL-6（ng／L）IL-8（ng／L）MPO（U／L）MMP-9（μg／L）5.83±0.44

Tab.3 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits lung tissue（±s，n＝8）

Tab.3 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits lung tissue（±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact group

Group IFN-γ（ng／L）Wet／Dry ratio Intact 840.22±28.27 172.58±8.44 58.84±2.53 41.25±1.83 81.17±3.56 41.25±1.43 4.98±0.19 Diving 905.46±28.56**189.79±6.24**65.07±3.36**43.87±1.90*94.09±3.10**46.84±2.04**TNF-α（ng／L）IL-6（ng／L）IL-8（ng／L）MPO（U／L）MMP-9（μg／L）4.83±0.24

3 讨论

本实验根据Haldane减压理论计算所得的水下阶段减压表进行了模拟家兔100 m Trimix常规潜水［7］。通过比较潜水前、后家兔血清氧化／抗氧化指标、肺及脑组织炎性因子和湿干比的变化，明确100 m Trimix常规潜水对机体氧化应激和炎性反应的影响，国内尚属首次。为我国今后大深度Trimix人体实潜提供了第一手资料，具有重要的指导意义。

机体在潜水或高气压时处于应激状态［8］。本实验中，家兔潜水时的氧化应激主要来自呼吸气高氧分压，家兔在100 m停留阶段承受8倍常氧分压（1.6 ATA）的压力。Bitterman等［9，10］在人体及大鼠的实验中均证实，单纯高压氧（280 kPa，90 min）暴露即可引起淋巴细胞亚型的改变，CD4+／CD8+比值在暴露后明显降低。机体处于氧化应激状态时，产生大量氧自由基，抗氧化物质损耗加快，可引起炎性因子的改变［11，12］。

本研究结果表明，家兔潜水后血清氧化／抗氧化指标发生显著改变，主要表现为SOD及GSH活力下降，MAD和LPO含量增加，说明潜水时的氧化应激导致家兔抗氧化能力降低，自由基产生增多。CAT活性增强可能是过高的自由基或过氧化物浓度刺激导致的代偿性改变，CAT活性升高不仅可以清除H2O2和其它过氧化物，其对自由基产生的多种途径也有一定的抑制作用。模拟100 m Trimix常规潜水减压后家兔肺、脑组织炎性因子 IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-8水平均较空白组显著升高，其可能机制是氧化应激激活了转录因子如核因子NF-κ和激活蛋白，转录因子调节多种炎性反应介质如IL-8和TNF-α等的释放。另一方面，募集在肺、脑组织的多种炎性细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞又可释放H2O2，等，加重氧化应激。从而形成氧化应激-炎性反应-氧化物质增多-氧化应激加重一系列链式或链式支链反应。家兔在模拟100 m Trimix常规潜水后肺、脑组织MPO和MMP-9较空白组显著升高，可能的机制是高压／高氧分压导致的氧化应激使得机体MPO活性增加、MMPs系统激活，而MPO活性的增加又通过抑制基质金属蛋白酶抑制剂-1和激活基质金属蛋白酶原-2使机体产生更多的MMP-9，从而形成正反馈。潜水组家兔组织湿干比较空白组未见显著改变，提示潜水后兔肺间质及肺泡血管通透性良好，血脑屏障及脑微循环正常，机体未发生因潜水引起的肺、脑水肿，说明组织炎性因子表达升高但并未产生病理性炎症反应。

综上，模拟100 m Trimix常规潜水时的高氧分压使家兔处于氧化应激状态，氧化应激改变了机体原有的氧化-抗氧化平衡，氧化和还原产物的改变进而激活促进了机体的炎性反应，炎性细胞因子释放增多，反过来继续加重氧化应激，形成氧化应激和炎性反应相互作用、共同参与的防御机制。本实验结果提示按照Haldane减压理论建立的模拟兔100 m Trimix常规潜水暴露方案是可行的，但应用到人体实验和实际作业时仍需进一步深化研究和验证。

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［6］ Bennett PB，Coggin R，Roby J.Control of HPNSin humans during rapid compression with trimix to 650 m（2131 ft）［J］.Undersea Biomed Res，1981，8（2）：85-100.

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