大豆多肽Lunasin对类风湿关节炎大鼠T细胞免疫指标的影响*

向艳丽，石思蓉，覃晓莉，赵方毓，唐鲜娥，陈显兵，3△

（1.恩施州中心血站，2.湖北民族学院医学院，3.湖北民族学院生物资源保护湖北省重点实验室，恩施445000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫性疾病，其致病原因迄今不是很清楚［1］。RA的病变是关节组织的炎性病变，最终形成不可逆性骨关节损伤。研究表明滑膜成纤维细胞在RA的发病过程中扮演相当重要的角色，其分泌大量前炎症因子如白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），对关节软骨和骨的破坏起关键作用［2］。近年来研究显示，Thl／Th2细胞及其分泌细胞因子的失衡与RA的发生息息相关［3］。

Lunasin是从大豆以及其他植物中分离纯化并鉴定出的一个43氨基酸残基多肽，具有抗氧化和抗炎等特性［4，5］。本实验中，给予RA大鼠不同剂量的Lunasin进行灌胃处理，观察Lunasin对类风湿关节炎大鼠滑膜液中淋巴细胞的活化的影响及免疫微环境的改变，为寻找治疗类风湿性关节炎药物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 多肽与试剂

大豆多肽Lunasin由上海生工合成；完全弗氏佐剂（Freund’s Adjuvant Complete，FCA）购自于美国 Sigma公司；所有抗体均购自于Santa Cruz公司。MTT试剂盒和Triton X-100购碧云天公司。

1.2 RA动物模型制作及分组

Wistar雄性大鼠50只，体重200～240 g，购自湖北省实验动物（许可证号：SCXK（鄂）2015-0018）。适应性喂养5 d后，按体重随机分为5组（n＝10）：对照组（A组，等量生理盐水灌胃）、模型组（B组，等量生理盐水灌胃）、0.1 mg／kg Lunasin灌胃（C组），0.2 mg／kg Lunasin灌胃（D组），0.4 mg／kg Lunasin灌胃（E组）。其中B组和C、D、E组大鼠在右后足垫处局部一次性注射FCA 0.1 ml［8］，A组注射等量生理盐水。实验过程中，室温控制在20℃～24℃，给予普通饲料，自由进食和饮水，治疗组Lunasin灌胃每天1次。于实验第21天测定足跖厚度后处死大鼠取病变组织常规切片。

1.3 关节滑膜液淋巴细胞分离

大鼠麻醉后，打开右后足足-踝关节腔，收集关节滑液，肝素抗凝（20 U／ml），离心 10 min（3 000 r／min），收集上清（备用），PBS重悬沉淀物，淋巴细胞分离液（Ficoll）分离淋巴细胞（1 500 r／min，15 min），调整细胞浓度为 1×106cells／ml，流式细胞分析。

1.4 关节滑膜液淋巴细胞活化标志的表达

采用单色荧光染色，在试管中分别加入200μl PE标记的抗体CD69、CD25单色同型对照免疫球蛋白，再加入100μl（1×106cells／ml）细胞悬液，混匀，室温暗处反应 15 min，流式细胞仪检测。

1.5 细胞因子检测

关节滑膜液上清，按ELISA试剂盒照操作说明，检测IL-12、TNF-β、IL-4和 IL-10的含量变化。

1.6 统计学分析

所有数据以均数±标准差（±s）表示，统计分析采用SPSS16.0软件进行数据分析。

2 结果

2.1 Lunasin减少淋巴细胞浸润并抑制滑膜细胞增生

模型组大鼠右足跖肿胀明显，局部变红，体积增大，厚度增加。光学显微镜下观察发现滑膜组织内大量淋巴细胞浸润，滑膜细胞增生，提示造模成功。同时发现在给予不同剂量Lunasin灌胃治疗后，与模型组相比较，滑膜增生明显得到改善，浸润的炎症细胞明显减少（图1）。

2.2 Lunasin抑制滑膜液中T淋巴细胞活化

流式检测结果显示：RA组大鼠关节滑膜液中淋巴细胞CD69+和CD25+表达量均明显增加（分别由3.72±1.09 pg／ml和 3.56±1.84 pg／ml上升到 4.52±1.32 pg／ml和 7.34±1.41 pg／ml）；而在给予不同浓度的大豆多肽 Lunasin灌胃治疗后，RA大鼠滑膜组织上CD69+和CD25+表达量均受到抑制，且呈一定剂量依赖关系。当灌胃给予模型大鼠0.2 mg／kg和 0.4 mg／kg Luansin治疗后，与此对照相比，RA模型大鼠关节滑膜液淋巴细胞上CD25+表达量明显下调（图2，P＜0.05）。

Fig.1 Lunasin reduced T lymphocyte infiltration and improved synovial cell hyperplasia（HE×200）

Fig.2 Lunasin inhibited T lymphocyte activity（±s，n＝5）

2.3 Lunasin促进Th1型细胞因子向Th2型细胞因子转化

RA模型组大鼠与对照组比较，滑膜液中IL-12、TNF-β含量都显著性升高，IL-4、IL-6比对照组减少。Luansin治疗后，RA实验大鼠关节滑膜液中IL-12以及TNF-β含量都呈下降趋势，且呈剂量依赖关系，在给予0.4mg／kg Luansin治疗时，Th1型细胞因子降低最大，与模型组相比达到显著性差异。IL-4、IL-10含量则随着Lunasin剂量的提高逐步增加，同样在0.4 mg／kg Luansin治疗时Th2型细胞因子含量与模型组相比显著性升高（图3）。

3 讨论

Fig.3 Lunasin promoted excursion of Th1／Th2 cytokines to Th2 cytokines（±s，n＝5）

类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，T淋巴细胞、巨噬细胞以及浆细胞浸润为其特征［6］。成功构建RA大鼠模型后，给予不同剂量的大豆多肽Lunasin治疗后，滑膜组织T淋巴细胞浸润现象得到明显改善，滑膜细胞增生得到显著抑制。已有大量证据表明，RA患者滑膜液中T细胞处于过度激活状态［7］。在本研究中，我们也发现RA模型鼠滑膜液中T淋巴细胞表面活化标记物CD69+和CD25+表达量显著上升。而在给予不同剂量大豆多肽Lunasin治疗后，CD69+和CD25+表达量较模型组均呈现下降趋势。高度活化的T淋巴细胞可以通过直接或者间接的调控方式调控巨噬细胞，B细胞以及其他T细胞，从而导致相关炎症因子的分泌增多，引发滑膜炎症和增生。CD69+是一种相当敏感的T细胞活化早期表达产物，CD25+则是T细胞活化晚期表达产物［8］。从上述结果我们可以得出结论，Lunasin可以通过抑制T细胞的活化而降低关节滑膜处微环境自身免疫反应的发生。

研究证实Th1／Th2型细胞因子的失衡是RA发病的重要机制之一。李景怡等［9］对41例类风湿关节炎患者的研究发现，RA患者滑膜液中Th1型细胞因子的表达量较高，Th2型细胞因子的表达量较低，认为在类风湿关节炎中以Th1型细胞因子极化诱导炎症的产生为主，这与本研究结果一致。实验中发现，进行Lunaisn治疗后，可有效地降低RA模型大鼠滑膜液中Th1型细胞因子的产生，促进Th2型细胞因子的分泌，提示Lunasin可通过调节RA患者滑膜液中Th1／Th2型细胞因子的失衡，维持滑膜液免疫微环境稳定，从而有利于类风湿关节炎的治疗与康复。

Lunasin可通过抑制T淋巴细胞的异常活化，扭转h1／Th2型细胞及其分泌的细胞因子的失衡达到治疗RA的目的。根据前期的实验结果，大豆多肽Lunasin由于具有抑制滑膜成纤维细胞增值、诱导其凋亡、减少滑膜成纤维细胞中炎症因子的产生等作用［10］，lunasin有希望作为一种RA的潜在的、有效的候选药物或者营养补充药物，其作用机制有待进一步研究。

【参考文献】

［1］ Gabriel SE，Michaud K.Epidemiological studies in incidence， prevalence， mortality， and comorbidity of the rheumatic diseases［J］.Arthritis Res Ther，2009，11（3）：229.

［2］ 罗心静，莫选荣，周玲玲.Hsp72对类风湿关节炎滑膜细胞 IL-6、IL-8表达及 NF-κB活化的影响［J］.中国应用生理学杂志，2012，28（4）：336-339.

［3］ Niedermeier M，Pap T，Korb A.Therapeutic opportunities in fibroblasts in inflammatory arthritis［J］.Best Pract Res Clin Rheumatol，2010，24（4）：527-540.

［4］ Smith C，Andreakos E，Crawley JB，et al.NF-κB-inducing kinase is dispensable for activation of NF-kB in inflammatory settings but essential for lymphotoxin receptor activation of NF-kB in primary human fibroblasts［J］.J Immunol，2015，167（10）：5895-5903.

［5］ Jia S，Zhang S，Yuan H，et al.Lunasin Inhibits Cell Proliferation via Apoptosis and Reduces the Production of Proinflammatory Cytokines in Cultured Rheumatoid Arthritis Synovial Fibroblasts［J］.Biomed Res Int，2015：346-839.

［6］ 王克义，朱 华，卓广超，等.类风湿关节炎患者关节滑膜液免疫细胞功能分析［J］.医学研究杂志，2007，36（12）：17-20.

［7］ Voigt H，Schrama D，Eggert AO，et al.CD28-mediated costimulation impacts on the differentiation of DCvaccination-induced T cell responses［J］.Clin Exp Immunol，2006，143（1）：93-102.

［8］ 王小琴，彭聿平，刘 展，等.胶原诱导性关节炎小鼠细胞亚群表达酪氨酸羟化酶的作用［J］.中国应用生理学杂志，2014，30（5）：390-394.

［9］ 李景怡，方勇飞，邹丽云，等.Th1／Th2细胞因子谱在类风湿关节炎患者外周血和关节积液的表达及意义［J］.第三军医大学学报，2010，32（18）：1921-1924.

［10］陈显兵，王玲洁，何一多，等.大豆多肽Lunasin对实验性类风湿关节炎大鼠细胞免疫功能的影响［J］.基础医学与临床，2016，32（6）：849-851.