普通菜豆中烟草水杨酸结合蛋白2同源基因的鉴定及表达特征分析

薛仁风 王 利 丰 明 葛维德,*



普通菜豆中烟草水杨酸结合蛋白2同源基因的鉴定及表达特征分析

薛仁风1,**王 利2,**丰 明1葛维德1,*

1辽宁省农业科学院作物研究所, 辽宁沈阳 110161;2农业部农业生态与资源保护总站, 北京 100125

水杨酸(salicylic acid, SA)能够诱导植物产生系统抗病性反应, 而水杨酸结合蛋白2 (salicylic acid binding protein 2, SABP2)是植物细胞内调控水杨酸水平的重要酯酶。本研究利用生物信息学方法在普通菜豆中搜索到7个烟草水杨酸结合蛋白2的同源基因, 命名为。分别在2个菜豆感病品种(白刀豆和BRB130)和2个抗病品种(黑芸豆和260205)中接种尖镰孢菌FOP-DM01菌株(f. sp.isolate, FOP-DM01)后, 检测寄主根组织中水解水杨酰甲酯(methyl salicylate, MeSA)活性和游离SA含量的变化, 并利用荧光定量PCR技术分析7个基因表达量变化。结果表明,、、、和的转录表达受FOP-DM01菌株诱导均呈现不同程度的升高, 其中黑芸豆中基因和260205中基因表达量变化最显著, 接种3 d后分别升高至0 d表达量的7.6倍和5.6倍。此外, 黑芸豆和260205根中水杨酰甲酯酯酶(methyl salicylate esterase, MES)活性显著提升, 游离SA含量也相应升高, 激活寄主内SA介导的相关防御反应。本研究结果可以为普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病分子育种和抗病机理研究提供理论基础。

普通菜豆; 镰孢菌枯萎病; 水杨酸结合蛋白2; 直系同源基因; 系统获得性抗性

普通菜豆(L.)是最重要的食用豆类之一, 是人类摄取蛋白质、维生素和矿质元素的重要来源[1]。普通菜豆多种植于土壤贫瘠区, 因此容易遭受多种病原物危害而减产, 其中以土传病害最为严重。普通菜豆镰孢菌枯萎病(Fusarium wilt)属于普通菜豆维管束类病害的一种, 是由尖镰孢菌菜豆专化型(f. sp., Fop)引起的典型土传真菌病害, 给普通菜豆生产带来很大危害[2]。

水杨酸(salicylic acid, SA)作为一种介导植物抗病反应重要的信号分子, 在普通菜豆抗镰孢菌枯萎病的防御反应中具有极其重要的作用[3]。植物通过水杨酰甲酯酯酶(methyl salicylate esterase, MES)水解水杨酰甲酯(methyl salicylate, MeSA), 从而释放出具有生物活性的游离SA, 诱导植物细胞内SA相关的抗病防御反应, 提高植物免疫力[4-5]。SA与许多植物镰孢菌枯萎病的抗病性都存在着密切的联系, 受外源SA诱导条件下, 拟南芥[6]、番茄[7]、海枣[8]、鹰嘴豆[9]、普通菜豆[3]等对的抗性均显著提高。SA是许多种植物防御系统中重要的信号分子, 因此在植物体内直接影响SA水平的调节因子就必然与植物的抗病性存在密切的联系。水杨酸结合蛋白2 (salicylic acid binding protein 2, SABP2)就是这样一类直接参与调控植物体内SA水平的蛋白。SABP2具有MES活性, 在植物体内将MeSA转化成游离SA, 提高植物体内SA水平, 对激发植物系统抗性具有极其关键的作用[10]。相关研究表明, 烟草基因编码29 kD蛋白质, 该蛋白能够水解MeSA生成SA, 从而诱导寄主产生系统获得性抗性[11-14]。此外, Chigurupati等[15]研究表明, SABP2是烟草中SA介导的信号传导途径关键因子, 在烟草受非寄主病原诱导发生的抗性反应中发挥重要作用。Vlot等[16]研究表明, 拟南芥中基因的直系同源基因基因家族的、和在丁香假单胞菌诱导条件下表达量显著升高, 功能验证试验结果表明,、、和在诱导拟南芥发生系统获得性抗性反应中具有十分关键的作用。Manosalva等[17]研究表明, 马铃薯中基因的直系同源基因在寄主抵御致病疫霉侵染过程中同样也发挥着相似的重要功能。

植物细胞内存在一个SA参与的复杂信号调节网络, 而基因作为植物内源SA重要的调控节点蛋白, 目前仅有少数几个基因通过功能验证实验被证明参与了植物的抗病反应, 而且主要集中在模式植物上。因此本研究选择普通菜豆中烟草基因()的同源基因作为目的基因, 研究基因家族成员在普通菜豆枯萎病抗病反应中的功能, 有望在普通菜豆抗病分子育种和抗病机理的研究中取得重要的突破。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通菜豆品种BRB130 (编号为F0004322)、白刀豆(编号为F0001298)、260205 (编号为F0005035)和黑芸豆(编号为F0004852)由中国农业科学院作物科学研究所提供。将菜豆种子播于灭菌的营养土中, 23~28℃条件下, 每日补充12 h光照, 培养7~10 d, 以备接种。供试菌株为FOP-DM01。病原菌首先接种于PDA (Potato Dextrose Agar)平板上, 25~28℃培养7 d, 然后用于接种。

1.2 接种与样品的采集

参照薛仁风等[18]方法接种病原菌; 分别从0、1和3 d接种和未接种的菜豆植株根部取样, 每个处理3次生物学重复; 将样品保存于−80℃, 用于基因表达量、MES活性和SA含量分析。

1.3 PvMES家族基因预测与序列分析

利用烟草中SABP2蛋白质序列(登录号为Q6RYA0)搜索普通菜豆基因组数据库(http://www. phytozome.net/), 分析普通菜豆家族基因, 获得7个普通菜豆中基因的直系同源基因序列, 命名为~。根据推测的PvMES氨基酸序列, 利用ClustalX 1.83和MEGA 4.0软件分别进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析。

1.4 总RNA的提取与cDNA合成

采用TRIzol试剂(TianGen, China)提取处理和对照各时间点样品的总RNA, 按照 Reverse Transcriptase System试剂盒(Promega, USA)操作说明书合成第1链cDNA, 采用Oligo d(T)15反转录引物。

1.5 实时荧光定量PCR分析基因表达量

根据~和的cDNA序列设计定量PCR引物(表1)。以普通菜豆的基因作为内参, 采用SuperRealPreMix (SYBR Green, TianGen, China) 荧光定量PCR试剂和qTOWER 2.2实时定量PCR仪(Analytikjena, Germany), 以各个取样时间点的cDNA为模板分析家族基因的表达情况。参照试剂说明中的反应体系与程序。反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线, 以PCR产物电泳确认扩增产物特异性。采用2−ΔΔCT法分析数据, 确定基因的相对表达量。设每个取样时间点3个生物学重复, 在同一个批次完成内参基因和目标基因的PCR反应。

表1 实验中所用的引物

1.6 MES活性及SA含量的测定

分别取各时间点采集样品, 用液氮研磨成粉末, 溶解于预冷Tris-HCl缓冲液中, 6000´离心30 min, 收集上清液用于MES活性测定。参照Forouhar等[19]测定方法, 将上清液与MeSA混合, 于37℃温浴30 min, 加入水杨酸甲基转移酶和14C-S-腺苷甲硫氨酸标记水解产生的SA, 生成14C-MeSA, 加入等体积乙酸乙酯, 混匀后离心提取有机相, 通过闪烁计数仪定量分析14C-MeSA含量, 计算上清液MES活性; 另取各时间点采集样品, 用于游离SA含量测定。参照薛仁风等[3]的方法, 取300~1000 mg根组织, 用液氮研磨后溶于3 mL 80%甲醇, 置4℃过夜。将样品 4℃, 9000´离心10 min, 取上清液, 将沉淀再次悬浮于2 mL甲醇中, 4℃黑暗放置6 h, 4℃条件下10 000´离心10 min, 取上清液, 将两组上清液混合后取0.5 mL置于40℃条件下真空干燥, 将提取物用0.3 mL 5%三氯乙酸抽提后, 加入2倍体积环戊烷∶乙酸乙酯∶异丙醇(50∶50∶1), 充分混匀后离心, 取有机相真空干燥, 将干燥产物溶解于乙腈, 用高效液相色谱仪(HPLC)测定SA含量。

1.7 发病情况调查与评价

采用1~9级的病级评价标准[20], 在接种后每天记录发病植株的病级。共设3个重复, 每个重复10株菜豆幼苗。平均发病级别=S(发病级别/调查总株数); 病情指数=S(发病级数×相应的发病植株数)/(9×植株总数)×100%。

1.8 数据分析

采用SAS统计分析软件中LSD法进行单因素方差分析[21], 采用Microsoft Excel 2010软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 PvMES基因序列及编码蛋白质序列分析

根据基因cDNA序列, 利用生物信息学方法在普通菜豆基因组数据库(http://www. phytozome.net/)中搜索基因的同源序列, 共获得7个基因的直系同源基因, 分别命名为~(表2)。其中位于第3染色体,位于第2染色体,位于第10染色体。基因序列与基因序列一致性各不相同, 其中最高, 达到63.8%,最低, 仅为45.3%。

NtSABP2蛋白质序列包括260个氨基酸, 理论蛋白分子质量为29.3 kDa, 等电点为5.39。该蛋白包含3个活性位点(Ser81、Asp210、His238), 共同组成具有水解MeSA活性的结构域。此外, NtSABP2序列中有15个与SA互作的活性位点; PvMES1序列中3个水解活性位点均与NtSABP2相同, SA互作位点有14个与NtSABP2相同; PvMES2序列中有2个水解活性位点和11个SA互作位点与NtSABP2相同; PvMES3~PvMES7序列3个水解活性位点均与NtSABP2相同, 而SA互作位点数则均与NtSABP2不同, 分别为13、11、15、9和6 (图1)。该结果表明,基因家族不同成员可能具有不同的生化特性和生物学功能。

表2 PvMES家族基因与烟草水杨酸结合蛋白2核苷酸序列分析

图1 PvMES1~PvMES7和NtSABP2氨基酸序列比对分析

相同位点用黑色表示, 相似位点用灰色表示; 水解活性位点用黑色箭头表示。SA结合位点用黑色三角形表示。

Identical residues are shaded in black and similar residues in gray; the catalytic triad residues are indicated by arrows, and residues that contact salicylic acid are indicated with black triangles.

基因家族成员按照与NtSABP2序列的亲缘关系可分为三个亚家族,、和的亲缘关系较近, 组成亚家族I,、和三个成员亲缘关系较近, 组成亚家族II,组成亚家族III(图2)。目前在拟南芥、马铃薯等作物中均有基因家族的相关研究报道[16-17], 但在普通菜豆中尚无基因的研究成果。

2.2 PvMES基因的诱导表达分析

接种FOP-DM01菌株1 d后, 4个菜豆品种根中表达量均有所上调, 但不显著, 接种3 d后, 抗病品种黑芸豆和260205根中表达量显著高于感病品种BRB130和白刀豆, 与0 d表达量相比, 分别上升至3.9倍和5.6倍;基因的表达量在接种病原菌后的4个品种中, 不同时间段并没有发生显著变化; 在接种病原菌1 d后, 抗病品种黑芸豆和260205根中表达量显著高于感病品种BRB130和白刀豆, 接种3 d后, 2个抗病品种的表达量继续升高, 显著高于2个感病品种, 与0 d表达量相比, 分别提高至1.9倍和4.3倍;表达量在接种病原菌3 d后的4个菜豆品种中均升高, 黑芸豆根中表达量升高至2.5倍, 高于其他3个品种;表达量在接种病原菌后均显著升高, 接种1 d后, 黑芸豆和260205根中表达量显著高于BRB130和白刀豆, 接种3 d后, 黑芸豆和260205根中表达量分别升高至0 d表达量的7.6倍和5.4倍; 接种病原菌后, 4个菜豆品种中表达量均逐渐升高, 在接种3 d后, 黑芸豆根中表达量升高至3.7倍, 显著高于其他3个品种; 而基因的表达量在接种病原菌后的4个品种根中没有发生显著变化; 在此互作过程中, 寄主基因作为阳性对照, 在接菌1 d后表达量显著升高(图3)。结果表明,基因家族7个成员中,、、、和的转录表达受 FOP-DM01菌株诱导均呈现不同程度的升高, 推测这5个基因与菜豆镰孢菌枯萎病抗病反应关系密切, 其中黑芸豆基因在接种3 d后表达量变化最显著, 升高至7.6倍, 说明该基因可能对抗病品种黑芸豆的抗病性起到关键作用, 而抗病品种260205接种3 d后表达量升高最明显, 达5.6倍, 表明其可能对寄主诱导自身抗病反应的发生最重要。

图2 PvMES1~PvMES7和NtSABP2进化树分析

2.3 MES活性分析

MES活性与普通菜豆应答枯萎病原菌FOP-DM01菌株侵染密切相关。研究表明, 在接种病原菌1 d后, 4个品种普通菜豆根MES活性均升高, 但并不显著, 接种3 d后, 抗病品种黑芸豆和260205根中MES活性显著升高, 分别为0.043和0.057 μmol min–1mg–1, 显著高于感病品种BRB130和白刀豆(图4), 表现出对病原菌更强的抗病性。

图3 FOP-DM01菌株诱导下普通菜豆根组织PvMES1~PvMES7和PvPR1表达量

相同时间点中标以不同字母的柱值在不同品种间差异显著(< 0.05)。

Bars represented by different letters are significantly different (< 0.05) among four common bean varieties at the same time point.

2.4 游离SA含量分析

接种病原菌1 d后, 普通菜豆抗病品种和感病品种根中SA含量略有上升, 但并没有明显差异; 接种病原菌3 d后, 抗病品种黑芸豆和260205根中SA含量显著升高, 分别为264.1和287.0 ng g–1FW, 均高于感病品种BRB130和白刀豆(图5), MES活性的升高是其更强抗病性的基础。

图4 FOP-DM01菌株诱导下普通菜豆根组织MES活性

相同时间点中标以不同字母的柱值在不同品种间差异显著(< 0.05)。

Bars represented by different letters are significantly different (< 0.05) among four common bean varieties at the same time point.

2.5 不同品种普通菜豆发病级别的调查

接种FOP-DM01菌株3周后, 感病品种BRB130和白刀豆表现出明显的叶片枯萎、褪绿变黄和根系变褐腐烂等发病症状, 而抗病品种黑芸豆和260205仅少数植株表现出轻微的发病症状; BRB130和白刀豆的平均病级数分别达到6.4和7.1, 病情指数分别为74.2和68.3, 而黑芸豆和260205平均病级数仅为2.9和2.7, 病情指数分别为38.1和27.7 (图6)。表型鉴定结果表明, 黑芸豆和260205对FOP-DM01菌株的抗病性要强于BRB130和白刀豆。

图5 FOP-DM01菌株诱导下普通菜豆根组织SA含量分析

相同时间点中标以不同字母的柱值在不同品种间差异显著(< 0.05)。

Bars represented by different letters are significantly different (< 0.05) among four common bean varieties at the same time point.

图6 普通菜豆接种FOP-DM01菌株后的病情评价

A: 接种FOP-DM01菌株3周后发病情况; B: 接种FOP-DM01菌株3周后的病情指数。相同时间点中标以不同字母的柱值在不同品种间差异显著(< 0.05)。

A: Disease progress of the common bean varieties at three weeks post inoculation with FOP-DM01; B: Disease index of the common bean varieties plants at three weeks post inoculation with FOP-DM01. Bars represented by different letters are significantly different (< 0.05) among four common bean varieties at the same time point.

3 讨论

SA作为典型的植物信号分子, 通过激活抗病相关基因的表达提高寄主抗病性, 在植物系统抗性体系中具有非常重要的作用[22-24]。Spletzer和Enyedi[25]研究表明SA处理番茄显著地提升了寄主对链格孢菌的系统抗性。Szôke等[26]研究表明禾谷镰孢菌侵染感病或者中抗的玉米品种并不会导致寄主内SA含量明显变化, 而被其侵染的抗病品种体内的SA水平则显著升高。Wu等[27]揭示出香蕉受f. sp.侵染后细胞内SA含量显著升高, 并激活苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)和过氧化物酶(peroxidase, POX)等相关防御因子的表达, 从而诱导寄主系统获得性抗性(system acquired resistance, SAR)反应的发生。在植物细胞中MeSA是SA稳定的的无活性衍生物, 是植物体内SA主要的运输形式, 可经植物韧皮部从病原菌感染位点运送到效应部位。植物遭受病原菌侵袭后应激产生一些SA信号分子, 在SA甲基转移酶作用下生成MeSA, MeSA对SA水解酶不敏感(SA易受SA水解酶降解), 故可作为可移动的SAR信号, 从病原菌感染的局部位点运送到植物远端组织, 以激发起全植株水平的抵御病原菌的抗性[4-5,10]。因此, MES对于调控植物细胞内SA水平和建立植物抵御病原物侵染的抗性反应, 均是必不可少的调控因子。

比较基因组学的研究为揭示普通菜豆基因结构和功能提供了捷径[28]。种间的比较基因组学主要揭示物种间在基因组结构上的差异, 解析基因功能, 探索物种进化关系, 将模式植物基因组的相关信息转移到未知植物基因组中, 精确定位和克隆基因。因此, 通过分析普通菜豆与烟草等模式植物部分或全部基因序列的保守程度, 就可以利用普通菜豆与烟草基因组之间编码顺序上和结构上的同源性, 分析序列信息, 从而获得普通菜豆基因组中的相关序列, 进而揭示普通菜豆基因的潜在功能, 阐明物种进化关系及基因组的内在结构。众所周知, 植物细胞内存在一个SA参与的复杂信号调节网络, 而基因作为植物内源SA重要的调控节点蛋白, 目前仅有少数几个基因通过功能验证实验被证明参与了植物的抗病反应。烟草基因在寄主诱导产生系统获得性抗性过程中发挥重要作用,基因编码蛋白具有MeSA水解活性, 能够水解MeSA生成SA, 从而激活寄主内SA介导的抗病相关反应[11-15]。拟南芥中基因家族成员是基因同源基因, 其中、、和是激活寄主防御反应最关键的基因,家族基因表达量的升高显著提升了拟南芥的抗病性[16]。此外, 在致病疫霉侵染马铃薯过程中, 抑制基因的表达显著降低了MeSA转化为SA的效率, 从而显著削弱了马铃薯晚疫病抗病性[17]。本研究利用生物信息学方法搜索到普通菜豆中7个烟草水杨酸结合蛋白2的同源基因~, 其中、、、和的表达量受FOP-DM01菌株诱导均呈现不同程度的升高, 抗病品种的基因表达量显著高于感病品种, 并且抗病品种MES活性和游离SA含量也显著高于感病品种。试验结果表明, 在菜豆与病原菌的互作过程中, 抗病品种基因表达量迅速升高, MES活性显著提升, 从而水解产生游离SA, 激活了寄主内SA介导的相关防御反应。本研究结果有望在普通菜豆抗病分子育种和抗病机理的研究中取得重要进展, 关于基因家族各成员在菜豆与病原菌的互作中如何发挥抵抗病原菌侵染的功能, 我们将克隆基因家族各成员基因, 采用转基因技术和基因沉默技术获得基因过表达和基因沉默的转基因植株, 通过研究转基因植株抗病表型和生理生化指标的变化进一步验证基因家族各成员的生物学功能。

4 结论

搜索到普通菜豆中烟草水杨酸结合蛋白2的7个同源基因, 其中和的表达量受 FOP-DM01菌株诱导呈不同程度的升高; MES活性及其水解产生的游离SA含量在接种后也相应显著提升, 但接种后抗病品种中MES活性和游离SA含量都显著高于感病品种, 游离SA含量升高激活寄主体内SA介导的相关防御反应, 这是抗病品种的发病级别和病情指数显著低于感病品种的基础。

[1] Broughton W J, Hernandez G, Blair M, Beebe S, Gepts P, Vanderleyden J. Beans (spp.)—model food legumes., 2003, 252: 55-128

[2] Xue R F, Wu J, Zhu Z D, Wang L F, Wang X M, Wang S M, Blair M W. Differentially expressed genes in resistant and susceptible common bean (L.) genotypes in response tof. sp.., 2015, 10: e0127698, doi:10.1371/journal.pone.0127698

[3] Xue R F, Wu J, Wang L F, Blair M W, Wang X M, Ge W D, Zhu Z D, Wang S M. Salicylic acid enhances resistance tof. sp.in common beans (L.)., 2014, 33: 470–476

[4] Vlot A C, Dempsey D A, Klessig D F. Salicylic acid, amultifaceted hormone to combat disease., 2009, 47: 177–206

[5] Liu P P, von Dahl C C, Park S W, Klessig D F. Interconnection between methyl salicylate and lipid-based long-distance signaling during the development of systemic acquired resistance in Arabidopsis and tobacco., 2011, 155:1762–1768

[6] Edgar C I, McGrath K C, Dombrecht B, Manners J M, Maclean D C, Schenk P M, Kazan K. Salicylic acid mediates resistance to the vascular wilt pathogenin the model host., 2006, 35: 581–591

[7] Mandal S, Mallick N, Mitra A. Salicylic acid-induced resistance tof. sp.in tomato., 2009, 47: 642–649

[8] Dihazi A, Serghini M A, Jaiti F, Daayf F, Driouich A, Dihazi H, El Hadrami I. Structural and biochemical changes in salicylic-acid-treated date palm roots challenged withf. sp.., 2011, doi 10.4061/2011/ 280481

[9] Gayatridevi S, Jayalakshmi S, Sreeramulu K. Salicylic acid is a modulator of catalase isozymes in chickpea plants infected withf. sp.., 2012, 52:154–161

[10] Park S W, Kaimoyo E, Kumar D, Mosher S, Klessig D F. Methyl salicylate is a critical mobile signal for plant systemic acquired resistance., 2007, 318:113–116

[11] Kumar D, Klessig D F. High-affinity salicylic acid-binding protein 2 is required for plant innate immunity and has salicylic acid-stimulated lipase activity., 2003, 100: 16101–16106

[12] Tripathi D, Jiang Y L, Kumar D. SABP2, a methyl salicylate esterase is required for the systemic acquired resistance induced by acibenzolar-S-methyl in plants., 2010, 584: 3458–3463

[13] Park S W, Liu P P, Forouhar F, Volt A C, Tong L, Tiejen K, Klessig D F. Use of a synthetic salicylic acid analog to investigate the roles of methyl salicylate and its esterases in plant disease resistance., 2009, 284: 7307–7317

[14] Kumar D, Hotz T, Hossain M, Chigurupati P, Mayakoti A, Binda N, Zhao B Q, Tripathi D. Methyl salicylate esterases in plant immunity., 2012, 1: 47–51

[15] Chigurupati P, Haq I, Kumar D. Tobacco Methyl Salicylate Esterase Mediates Nonhost Resistance., 2016, 6: 48–55

[16] Vlot A C, Liu P P, Cameron R K, Park S W, Yang Y, Kumar D, Zhou F, Padukkavidana T, Gustafsson C, Pichersky E, Klessig D F. Identification of likely orthologs of tobacco salicylic acid-binding protein 2 and their role in systemic acquired resistance in., 2008, 56: 445–456

[17] Manosalva P M, Park S W, Forouhar F, Tong L, Fry W E, Klessig D F. Methyl esterase 1 () is required for systemic acquired resistance in potato., 2010, 23: 1151–1163

[18] 薛仁风, 朱振东, 王晓鸣, 王兰芬, 武小菲, 王述民. 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因的克隆及表达.作物学报, 2012, 38: 606–613Xue R F, Zhu Z D, Wang X M, Wang L F, Wu X F, Wang S M. Cloning and expression analysis of thewilt resistance-related genein common bean (L.)., 2011, 38: 606-613(in Chinese with English abstract)

[19] Forouhar F, Yang Y, Kumar D, Chen Y, Fridman E, Park S W, Chiang Y, Acton T B, Montelione G T, Pichersky E, Klessig D F, Tong L. Structural and biochemical studies identify tobacco SABP2 as a methyl salicylate esterase and implicate it in plant innate immunity., 2005, 102: 1773

[20] 王述民, 张亚芝, 魏淑红. 普通菜豆种质资源描述规范和数据标准. 北京: 中国农业出版社, 2006. p 64 Wang S M, Zhang Y Z, Wei S H. Descriptors and Data Standard for Common Bean (L.). Beijing: China Agriculture Press, 2006. p 64 (in Chinese)

[21] Institute S. SAS 9.1.3 Intelligence Platform: Single-user Installation Guide. SAS Institute Cary, NC, 2005

[22] Dempsey D A, Shah J, Klessig D F. Salicylic acid and disease resistance in plants., 1999, 18: 547–575

[23] Xue R F, Wu J, Chen M L, Zhu Z D, Wang L F, Wang X M, Blair M W, Wang S M. Cloning and characterization of a novel secretory root-expressed peroxidase gene from common bean (L.) infected withf. sp.., 2014, 34: 855–870

[24] Xue R F, Wu X B, Wang Y J, Zhuang Y, Chen J, Wu J, Ge W D,Wang L F, Wang S M, Blair M W. Hairy root transgene expression analysis of a secretory peroxidase () from common bean infected by Fusarium wilt., 2017, 260:1–7

[25] Spletzer M E, Enyedi A J. Salicylic acid induces resistance toin hydroponically grown tomato., 1999, 89: 722-727

[26] Szôke C, Pál M, Szalai G, Janda T, Rácz F, Marton C L. Potencial role of salicylic acid in tolerance of maize to., 2011, 55: 167–168

[27] Wu Y L, Yi G J, Peng X X, Huang B Z, Liu E, Zhang J J. Systemic acquired resistance in Cavendish banana induced by infection with an incompatible strain off. sp., 2013, 170 : 1039–1046

[28] 陈明丽, 王兰芬, 赵晓彦, 王述民. 普通菜豆基因组学及抗炭疽病遗传研究进展. 植物遗传资源学报, 2011, 12: 941–947Chen M L, Wang L F, Zhao X Y, Wang S M. Current research progress (L.) on Anthracnose resistant gene­tics and genomics of common bean., 2011, 12: 941–947 (in Chinese with English abstract)

Identification and Expression Analysis of Likely Orthologs of Tobacco Salicylic Acid Binding Protein 2 in Common Beans

XUE Ren-Feng1,**, WANG Li2,**, FENG Ming1, and GE Wei-De1,*

1Crop Research Institute, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Shenyang 110161, Liaoning, China;2Rural Energy and Environment Agency, Ministry of Agriculture, Beijing 100125, China

Salicylic acid can induce the systematic resistant response in plants, and salicylic acid-binding protein 2 is an important esterase in the regulation of salicylic acid content in plant cells. In this study, we used the bioinformatics method to search the orthologous genes of tobacco salicylic acid-binding protein 2 in common bean, which were designated as–, then analyzed the changes of MES activity and free SA accumulation in plant roots. The expression level of 7genes in susceptible varieties BRB130 and Baidaodou, resistant varieties Heiyundou and 260205 infected byf. sp.isolate FOP-DM01 was detected by Real time PCR, showing that the expression of, andwas significantly increased at three days after FOP-DM01 infection, with most significant increase of 7.6 folds and 5.6 folds forgene in Heiyundou andgene in 260205 at 0 day, respectively. The MES activity and free SA content in roots of Heiyundou and 260205 were also improved, which activated the relevant defense response reaction mediated by SA in the host. The results of this study provide a theoretical basis for the resistance molecular breeding of Fusarium wilt in common beans.

common bean; Fusarium wilt; salicylic acid binding protein 2; orthologous genes; system acquired resistance

2017-09-10;

2018-01-08;

2018-01-29.

葛维德, E-mail: snowweide@163.com, Tel: 024-31029901

10.3724/SP.J.1006.2018.00642

本研究由国家自然科学基金项目(31401447), 辽宁省博士科研启动基金(201501113), 特色粮油新品种选育及优质高效生产技术集成与示范(2018416023)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-09-08Z)资助。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31401447), the Liaoning Doctor Startup Foundation (201501113), the New Varieties Breeding, High Quality and Effective Technology Integration and Demonstration of Special Grain and Oil Crop (2018416023), and the China Agriculture Research System (CARS-08-Z8).

**同等贡献(Contributed equally to this work)

E-mail: xuerf82@163.com, Tel: 024-31029901

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180128.1953.006.html