不同浓度白藜芦醇对人骨肉瘤细胞MG⁃63增殖、凋亡的影响及机制研究

舒洋 陈实

江汉大学附属医院武汉市第六医院骨外科（武汉430015）

骨肉瘤（osteosarcoma）是骨科常见的恶性肿瘤，好发于青少年，其发病率占恶性骨肿瘤总数的20%，占儿童肿瘤总数的5%。骨肉瘤恶性程度高，早期即可发生广泛的肺转移，其预后差、生存率低。随着医疗技术的进步，骨肉瘤的早期诊断率、切除率、5年生存率都得到了一定的提高。但骨肉瘤初起病症状易被忽视，进展迅速，患者发现时晚期较多且生存率较低、预后差。术后并发症较多且严重，易复发、转移很快，这使得骨肉瘤的总体治疗效果还不理想。目前肿瘤最主要的治疗手段主要是手术切除和放、化疗，传统化疗药物虽然能够在短时间内快速地抑制肿瘤增生和转移，有效地控制晚期恶性肿瘤，但会给患者带来严重的毒副作用，这类药物对患者健康细胞造成不可逆转的损伤。因此，寻找一种低毒高效的化疗替代物是肿瘤治疗的一个主要研究方向，也是目前治疗肿瘤的发展趋势。

白藜芦醇（resveratrol）其分子式为C14H12O3，是一种非黄酮类多酚化合物，是从自然界广泛存在的葡萄、虎杖、花生等植物中提取的一种酚类成分［1-3］。目前已有研究证明白藜芦醇具有良好的抑制肺癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌等细胞的增殖和促进其凋亡的作用［4］。国外有学者［5］发现白藜芦醇对骨肉瘤有效，但其机制尚不明。本实验通过使用不同浓度的白藜芦醇干预骨肉瘤MG⁃63细胞，探讨白藜芦醇诱导骨肉瘤细胞凋亡的机制，研究白藜芦醇对骨肉瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡的影响，验证白藜芦醇对人体细胞毒性作用，将为临床治疗骨肉瘤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料人骨肉瘤细胞株MG⁃63购于上海拜力生物公司。白藜芦醇购自于美国Sigma公司，分别与培养基及DMSO 稀释为5、10、25、50、100、150 μmol/L用于本实验。DMEM培养基、胰蛋白酶（Trysin）、青霉素和链霉素（杭州吉诺公司），胎牛血清（GIBCO公司），兔抗人Caspase⁃3抗体、兔抗人Caspase⁃9抗体、兔抗人BAK抗体、兔抗人BAX抗体、兔抗人p53抗体、兔抗人Caspase⁃8抗体、兔抗人PARP抗体、兔抗人p21抗体、山羊抗兔β⁃actin二抗（美国cell signaling），磷酸盐缓冲液（美国Thermo公司），甘氨酸、SDS、Tris碱（美国MBCHEM公司），丙烯酰胺（美国Biomol公司），TEMED、过硫酸铵、丽春红S（美国Amresco公司），BCA蛋白定量试剂盒、预染蛋白Marker、ECL（大连宝生物公司），Tween 20（上海华舜生物工程有限公司），RIPA裂解液、PMSF（碧云天生物公司），Transwell细胞培养板、Matrigel胶（美国BD公司），凯基Annexin V⁃FITC细胞凋亡检测试剂盒、凯基细胞周期检测试剂盒（南京凯基生物公司），Roche TUNEL试剂盒（上海麦约尔生物技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分组及处理实验分为7组，分别为对照组（正常人体细胞）、5 μmol/L白藜芦醇组、10 μmol/L 白藜芦醇组、25 μmol/L 白藜芦醇组、50 μmol/L 白藜芦醇组、100 μmol/L 白藜芦醇组、150 μmol/L白藜芦醇组。5 μmol/L白藜芦醇组中加入含有1%血清和5 μmol/L白藜芦醇的DMEM；10 μmol/L白藜芦醇组中加入含有1%血清和10 μmol/L白藜芦醇的DMEM；25 μmol/L白藜芦醇组中加入含有1%血清和25 μmol/L白藜芦醇的DMEM；50 μmol/L白藜芦醇组中加入含有1%血清和50 μmol/L 白藜芦醇的DMEM；100 μmol/L 白藜芦醇组中加入含有1%血清和100 μmol/L白藜芦醇的DMEM；150 μmol/L白藜芦醇组中加入含有1%血清和150 μmol/L白藜芦醇的DMEM。

1.2.2 细胞活力检测使用MG⁃63细胞计数后调整悬液浓度，96孔板每孔加入100 μL，放入5%CO2，37℃温箱，待细胞贴壁，加入相应浓度的白藜芦醇，每孔100 μL，设4个复孔。同等条件的温箱孵育24 h，显微镜观察。再均加入0.5%MTT 20 μL溶液，温箱孵育4 h，然后用PBS洗3次，加入含MTT的培养液。之后去除孔内培养液，再加入二甲基亚砜150 μL使其充分溶解10 min后测量吸光度值。

1.2.3 Annexin V法检测细胞凋亡6孔板中使细胞密度为1×105/孔，孵育24 h，换液，加入不同浓度的白藜芦醇。孵育24、48 h后，分别收集MG⁃63细胞至离心管中，PBS洗涤后离心。倒去上层液体加入PBS均匀混合后，使用凋亡试剂盒，加入1× Binding Buffer使细胞1× 106/mL，取100 μL加入 EP 管中，再加入 5 μL FiTcAnnexin 以及 10 μL PI，室温下避光15 min，最后加入400 μL 1 × Binding Buffer。流式分析仪检测不同浓度细胞的凋亡。

1.2.4 罗氏凋亡试剂盒检测MG⁃63细胞凋亡不同浓度的白藜芦醇处理96孔板中的肿瘤细胞，去除培养液，PBS洗涤，分别加入免疫染色固定液100 μL保存。使用罗氏TUNEL试剂盒，加入相应染色剂染色，混匀。吸出后加入DAPI 50 μL，10 min，PBS洗涤3次。抗荧光淬灭试剂溶剂120 μL封片，荧光显微镜观察并拍照。

1.2.5 Western blot检测凋亡相关蛋白的表达MG⁃63细胞中各蛋白的表达：各条件培养48 h之后，裂解MG⁃63细胞提取蛋白，用Western blot分析，加入各种抗体，利用SDS⁃PAGE电泳，免疫印迹用增强化学发光法（ECL）显影、定洗片。结果用凝胶成像软件量扫描条带灰度。采用IPP6.0以图像分析软件检测。以β⁃actin作为内参，以灰度比值表作为内参，表示所检测蛋白质的相对含量。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件包进行数据处理。计量数据均以均数±标准差表示，均经正态性检验，符合正态分布、方差齐性，多组间均数比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），两组间比较采用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇处理人骨肿瘤细胞MG⁃63的抑制率随着浓度的增加，肿瘤细胞明显受到抑制，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

表1 白藜芦醇处理骨肿瘤细胞MG⁃63不同时间段各浓度间的抑制率Tab.1 The inhibition rate of resveratrol treatment of bone tumor cells at different concentrations at different time periods of MG⁃63 x ± s，%

2.2 白藜芦醇能导致骨肿瘤细胞MG⁃63的凋亡

图1 MTT检测不同浓度的白藜芦醇对MG⁃63细胞抑制率Fig.1 MTT assay the inhibition rate of resveratrol in different concentrations on MG⁃63 cells

2.2.1 流式细胞仪检测MG⁃63细胞的凋亡MG⁃63细胞加入不同浓度的白藜芦醇处理24 h后，发现白藜芦醇能使MG⁃63细胞凋亡，不同浓度作用下的MG⁃63细胞凋亡数递增，分别为（6.10±1.06）%、（11.10 ± 1.22）%、（18.10 ± 1.98）%；MG⁃63细胞加入不同浓度的白藜芦醇处理48 h后，细胞凋亡数递增为（14.96±1.59）%、（46.97±1.68）%、（65.02±4.59）%。不同浓度的白藜芦醇处理MG⁃63细胞后呈现明显差异（P＜0.05）。而不同浓度白藜芦醇作用48 h的对照组，正常细胞凋亡数没有增加，有下降趋势。见图2。

图2 Annexin V法检测细胞凋亡Fig.2 Annexin V method was used to detect apoptosis

2.2.2 罗氏凋亡试剂盒检测MG⁃63细胞的凋亡用不同浓度的白藜芦醇（0、50、100 μmol/L）加入人骨肉瘤细胞MG⁃63孵育，24 h后MG⁃63细胞的凋亡率分别为（1.15 ± 0.09）%、（0.06 ± 0.02）%、（8.10 ± 0.66）%；48 h后MG⁃63细胞的凋亡率分别为（0.04±0.03）%、（21.47±1.98）%、（39.23±1.45）%，不同浓度的白藜芦醇处理后，差异有显著性（P＜0.05）。对照组用≥50 μmol/L白藜芦醇处理后，正常细胞未出现凋亡现象。随着浓度的增加，人骨肉瘤细胞MG⁃63凋亡细胞增加，而对照组几乎无任何凋亡现象。见图3。

图3 TUNEL法检测细胞凋亡Fig.3 TUNEL assay for cell apoptosis

2.3 Western blot法测MG⁃63细胞中各蛋白表达用不同浓度的白藜芦醇（0、50、100 μmol/L）处理MG⁃63细胞，检测出Bax、Bak、p53蛋白表达随着给药浓度的增加灰度值递增，差异有统计学意义（P＜0.01）。Caspase⁃3副条带蛋白值为19 kD的灰度值随着给药浓度增加也出现递增趋势（P＜0.05）。对照组检测的Bax、Bak、p53、Caspase⁃3、Cas⁃pase⁃9蛋白的表达均没有明显改变。见图4。

图4 白藜芦醇诱导骨肿瘤细胞凋亡相关蛋白的表达Fig.4 OS induces the expression of apoptosis related proteins in bone tumor cells

3 讨论

白藜芦醇是一种多酚类物质，具有多重生物学效性。因证实红酒中有心脑血管保护作用的一种重要有效成分而广受关注。后续研究中发现白藜芦醇不仅有心血管保护作用，还能抑制肿瘤细胞的生长［6］。本研究中白藜芦醇能上调p53蛋白的表达，抑制Bcl⁃2蛋白的表达，导致骨肿瘤细胞的抑制和凋亡等，证实了白藜芦醇能在一定程度上对骨肉瘤细胞产生作用。有研究发现白藜芦醇也可以通过影响骨肉瘤细胞中MMP⁃2的表达来影响细胞增殖和迁移，起到抗肿瘤的作用［7］。本研究结果说明白藜芦醇能不同程度的抑制骨肿瘤MG⁃63细胞，对照组几乎没有影响，Caspase⁃3（p19）的表达增加，从而导致骨肿瘤细胞的凋亡。p53基因是1979年发现分子量为53 kD的尿蛋白［8-9］，该蛋白在肿瘤细胞中表达量增高［10］，p53基因是目前世界上研究最多最热门的一个基因，它是一种抑癌基因，与细胞的生长、分化、死亡有重要的关系及联系，近年来研究表明其与细胞的凋亡有关［11］，p53在BCL⁃2蛋白家族依赖的细胞调控中有重要作用，p53可通过下调BCL⁃2的表达使BAX激活，进而影响细胞的凋亡［12］。细胞的凋亡途径主要有内在、外在及内质网和高尔基信号途径。p53能通过凋亡途径导致肿瘤细胞的凋亡［13-14］，NAKAGAWA等［15］发现Caspase⁃12 存在于内质网，当内质网钙离子动态平衡破坏或过多蛋白积聚于内质网时可激活 Caspase⁃12，激活的Caspase⁃12可进一步剪切Caspase⁃3导致细胞的凋亡，也发现p53不仅对线粒体通路而且对死亡受体通路均可导致凋亡的发生，具有转录和活化Bax、Bak的能力，通过线粒体凋亡通路以及内质网通路起到调控作用［16-17］。也有研究发现p53可激活Bax、Bak的活化，配合线粒体上细胞色素c和Smac/diablo蛋白的释放，导致凋亡因子Caspase⁃9和Caspase⁃3的活化导致凋亡，也可以直接激活cleaved Caspase⁃3（p19）［18-19］而导致凋亡。本研究的结论：白藜芦醇能使p53蛋白上调，激活Bax和 Bak，并抑制 Bcl⁃2蛋白，激活Caspase⁃3发生剪切作用，导致骨肉瘤细胞的凋亡。本研究结论是发现Caspase⁃3（p19）的激活直接导致骨肉瘤细胞的凋亡，可能并未通过经典的凋亡通路导致肿瘤细胞的凋亡。并且白藜芦醇对人体无害，抑制率还有下降表现，可能对人体有保护作用，需进一步研究。

如今我们治疗骨肉瘤仍然采取传统的手术以及术后的化疗，手术给我们的身心带来创伤，而术后的化疗会出现不同的毒副反应，导致患者生存质量的下降，甚至不能耐药被迫中止治疗。此时若有一种低毒高效的植物提取物取代传统的化疗药物将是患者的福音，也是医疗治疗上的一个里程碑。目前白藜芦醇的研究还在初步阶段，但是已经初步证实了白藜芦醇具有抗肿瘤的作用，白藜芦醇来源广泛，开发利用简单，深入研究其抗肿瘤机制对临床肿瘤患者的治疗上具有更现实的意义。

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