LHX6基因在肺癌中的甲基化及表达

张明谦 李艳 毕瑜 罗文娟 韩飞

1昆明医科大学附属延安医院急诊医学科（昆明 650051）；2中国人民解放军第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所（重庆 400038）

现今世界范围内肺癌已成为肿瘤性疾病中排名第一的恶性肿瘤［1-2］，因其预后差及病死率高，已严重威胁人类健康。目前，超过60%的新诊断肺癌患者被确定为临床晚期患者。大多数晚期肺癌患者已经发生了远处器官转移，从而失去手术根除治疗的可行性，这也是肺癌死亡率极高的最主要原因。因此，寻找有效的早期诊断和靶向治疗方法是降低肺癌死亡率的重要手段。

肺癌形成是一个遗传和表观遗传异常积累的多步骤过程。众多研究［3-5］已证实DNA甲基化作为表观遗传的最主要形式之一广泛参与了肿瘤的形成过程，其主要原因是DNA高甲基化常常致使重要肿瘤抑癌基因表达失活。因此，筛选和鉴定新的功能性甲基化调控基因对全面阐明肺癌发生的分子机制和寻找更好的肺癌诊断及治疗靶点并最终有效防控肺癌具有重要意义。

人类 LHX6（LIM homeobox domain 6）基因定位于第9号染色体的q33.2位置，是编码LIM同源域的转录因子之一，参与胚胎发育过程和影响多器官系统形态发生［6-7］。在肿瘤方面有研究［8-9］认为LHX6基因甲基化可以作为一个识别头颈癌的甲基化标记物，而在宫颈癌中则可能具有重要的早期诊断价值。近期课题组发现LHX6基因在肺癌中呈现了高甲基化，但LHX6基因在肺癌中甲基化程度与其表达之间关系以及该基因在肺癌中的生物学功能目前还不清楚，因此，本研究采用甲基化特异性PCR（methylmion Specific PCR MSP）并结合RT⁃PCR和qPCR方法检测了肺癌组织和癌旁组织、正常肺组织、肺癌细胞系中LHX6基因的甲基化水平及该基因表达水平。同时通过过表达LHX6基因后对肿瘤细胞的生长、增殖影响进行观察，初步获取该基因在肺癌中的生物学功能，为深入研究LHX6基因在疾病发生、信号通路等方面提供资料。

1 材料与方法

1.1 临床标本和细胞来源本实验临床标本来自于2016年1月至2017年10月昆明医科大学附属延安医院胸外科手术切除肺癌患者肿瘤标本及中国人民解放军第三军医大学毒理研究所标本库，配对癌旁组织均距离肿瘤边缘＞2 cm，标本离体后按标准标本处置流程制作成石蜡包埋蜡块。入选标本患者均未接受化疗及放疗治疗。研究通过昆明医科大学附属延安医院医学伦理委员会批准，招募患者均签署了知情同意书。

实验所用肺癌细胞系均购自于中国科学院上海生命科学研究院资源中心，肺癌细胞系保存和制备均符合实验要求。

1.2 方法

1.2.1 MSP检测石蜡包埋组织通过二甲苯脱蜡处理获取组织，肺癌细胞系按要求进行培养并消化收集所需细胞，通过DNA提取试剂盒对组织和细胞DNA进行提取，琼脂凝胶电泳对产物进行验证。DNA methylation⁃gold kit试剂对产物修饰处理后进行PCR扩增。引物如表1。

1.2.2 RT⁃PCR与qPCR肿瘤组织通过经典Trizol法提取总RNA，测定OD260/OD280值，逆转录为cDNA后储存在-20℃冰箱待用。RT⁃PCR产物使用2.5%的琼脂糖胶进行电泳检测，qPCR使用荧光定量仪器进行测定，结果分析使用2⁃ΔΔCT法计算。引物如表2。

表1 甲基化特异性PCR（MSP）引物设计Tab.1 Design of primers for methylation specific PCR（MSP）

表2 实时定量基因扩增荧光检测系统（qPCR）引物设计Tab.2 Design of primers for Real⁃time Quantitative PCR

1.2.3 免疫组化Anti⁃LHX6购自Santa Cruz Biotechnology公司（ab57064）。按实验说明进行稀释，免疫组化实验结果通过细胞的染色强度和阳性率的乘积进行表达水平定量，具体如下：按染色阳性率及染色强度进行评分，其中染色阳性率分值4分（≤ 5%，0分；5% ～25%，1分；26% ～50%，2分；51% ～75% ，3分；＞76% ，4分），染色强度分值3分（阴性，0分；弱阳性，1分；中阳性，2分；强阳性，3分）。根据平均表达值对表达情况进行划分，0～7分为低表达组；8～12分为高表达组。

1.3 统计学方法本实验数据均采用SPSS 19.0统计软件处理。采用的统计学方法：（1）配对t检验；（2）χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LHX6基因在肺癌组织中及肺癌细胞系中的甲基化情况通过MSP对入选患者肺癌组织及实验所用肺癌细胞系LHX6基因甲基化分析发现，正常组织和癌旁组织与肺癌组织相比较，LHX6基因在肺癌组织中出现了明显甲基化情况P＜0.05；在肺癌细胞系中也出现了不同程度的甲基化情况，而正常支气管粘膜细胞该基因未发生甲基化，两者具有显著差异P＜0.05（图1）。

2.2 LHX6基因在肺癌组织中及肺癌细胞系中的表达情况通过免疫组化我们对LHX6基因在肺癌组织，癌旁组织LHX6基因表达情况进行了检测，结果发现与癌旁组织相比较，LHX6基因在癌组织中出现了低表达情况（图2），进一步通过RT⁃PCR与qPCR对LHX6基因在肺癌组织、癌旁组织及肺癌细胞系表达情况进行检测，结果发现该基因在癌组织中呈现了明显表达下降趋势，肺癌细胞系与正常支气管黏膜细胞HBE相比较LHX6基因表达也呈现明显低表达情况（图3）。

图1 LHX6基因在正常组织、肺癌组织及肺癌细胞株中甲基化检测结果Fig.1 Representative results of LHX6 methylation status were shown in human tissue and cell lines

图2 LHX6基因表达水平在正常癌旁组织及肺癌组织免疫组化检测结果Fig.2 LHX6 expression was tested in tumor and adjacent lung tissues of patients using IHC

Fig.3 The mRNA expression of LHX6 was analyzed in lung tissues and cell lines by RT⁃PCR and qPCR图3 LHX6基因在肺癌组织及肺癌细胞株中mRNA表达水平检测结果

2.3 LHX6基因甲基化与其表达的关系为了验证LHX6基因甲基化水平是否调控该基因表达，笔者在肺癌细胞系中进行了去甲基化药物5⁃杂氮-2-脱氧胞苷（5⁃aza⁃dC）处理，并对比处理前后肿瘤细胞中LHX6基因的表达情况，结果发现经去甲基化处理后，LHX6基因在肿瘤细胞中出现了表达升高的情况（图4），说明该基因表达受甲基化调控，甲基化程度与该基因表达呈负相关关系。

图4 5⁃杂氮⁃2⁃脱氧胞苷去甲基化处理后LHX6基因mRNA在肺癌细胞株表达检测结果Fig.4 The mRNA expression of LHX6 was restored in lung cancer cell lines after treatment with the demethylation agent 5⁃aza⁃dC

2.4 LHX6表达与肺癌患者临床特征关系分析对入组88名肺癌患者临床特征进行分析，研究对象年龄，性别，临床分期均无统计学差别，但该基因高表达组在组织学特征和淋巴结转移以及肿瘤组织大小与低表达相比较差异有统计学意义（表3），提示该基因表达与肺癌患者的肿瘤细胞恶性程度及肿瘤大小相关，与早期淋巴结转移也有一定关系。LHX6高表达后可以减轻肿瘤细胞恶性程度及肿瘤大小，且可以减少早期淋巴结转移的可能性。

2.5 LHX6基因在肺癌中的生物学功能初步研究为了初步探索LHX6基因在肺癌中的生物学功能，我们在肺癌细胞系中对LHX6基因过表达处理，并通过CCK8增殖实验和克隆形成实验对该基因过表达后对肿瘤细胞生长及增殖的影响，结果发现LHX6基因过表达后，肿瘤细胞生长及增殖明显受到抑制（图5），该基因具有明显的抑癌作用。

3 讨论

目前众多实验研究证实，在导致肿瘤性疾病发生多种原因中，表观遗传调控异常起着重要作用，其中以DNA甲基化导致抑癌基因沉默最终形成肿瘤的观点被广为接受［10-11］。因此深入开展因DNA甲基化引起的表观遗传变化对于有效控制肿瘤性疾病的发生具有重大的意义。

表3 88例肺癌患者LHX6表达水平与临床特征情况Tab.3 Correlations between LHX6 expression and clinical parameters in 88 lung adenocarcinoma patients 例

图5 LHX6基因抑制肿瘤细胞增殖（细胞增殖实验及克隆形成实验）Fig.5 LHX6 inhibits cancer cell growth by cck8 and Colony formation assays

LHX6基因作为编码LIM同源域的转录因子，在其启动子区域具有一个典型的CpG岛［12-13］。已有研究证实，该基因与肿瘤的发生关系密切，如头颈部肿瘤等［9］。而LHX6基因在肺癌中是否也存在DNA甲基化异常目前报道尚少，因此本实验通过对该基因在肺癌组织、癌旁组织及肺癌细胞系中甲基化情况进行检查，分析该基因甲基化与其表达的相关性，并初步探索该基因在肺癌中所发挥的生物学功能，为进一步深入研究LHX6基因提供实验数据。

通过实验笔者发现，与癌旁正常组织相比较LHX6基因在肺癌组织中呈现明显的高甲基化情况，同时相应的肺癌细胞系中（A549、95D、H358、H460、SPC⁃A⁃1）与正常支气管黏膜细胞（HBE）相比较，LHX6基因也呈现了不同程度的甲基化情况。笔者对肺癌组织、癌旁正常组织及肺癌细胞系中该基因的表达进行了进一步检测发现，LHX6基因在肺癌组织中和肺癌细胞系中均出现了表达下降情况。为了明确该基因甲基化是否调控其表达，我们在肺癌细胞系中应用5⁃杂氮⁃2⁃脱氧胞苷（5⁃aza⁃dC）进行了去甲基化处理，结果发现通过去甲基化处理后，该基因表达上调。因此，笔者认为LHX6基因在肺癌的发生过程中发生了由异常甲基化导致的异常情况表达，暗示LHX6可能在肺癌发生、发展中具有重要的作用。

为了初步探索LHX6基因肺癌发生、发展中可能的功能，笔者构建该基因表达载体，并对LHX6基因低表达或不表达肺癌细胞系进行过表达处理，通过细胞增殖实验（CCK8法）及克隆形成实验分析该基因过表达对肿瘤细胞增殖的影响。本研究结果发现，过表达LHX6基因后，肿瘤细胞增殖和克隆形成明显受到抑制。这些功能性数据表明，LHX6基因在肺癌中是一个重要的抑癌因子。不过，笔者对LHX6基因功能的研究仅处于探索阶段，目前该基因对肿瘤细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响还不清楚，而且LHX6基因发挥抑癌功能的具体信号通路研究也尚未开展，将在今后的工作中逐步深入研究。值得一提的是，笔者的最新数据显示LHX6的抑癌作用可能与Wnt/β⁃catenin信号通路有关［14-15］。

本研究的主要不足之处是肺癌样本量较小，不能进行更有意义的临床分析如该基因与病人预后的关系等。在接下来的研究将进一步扩大样本量，收集更详尽临床信息包括患者生存时间、放疗和化疗情况等，为分析和确定该基因能否可以应用于临床防治奠定基础。

综上所述，LHX6基因在肺癌及肺癌细胞系中表现为高甲基化情况，且其甲基化程度调控该基因表达，过表达该基因后可以显著抑制肿瘤细胞增殖，因此笔者认为LHX6基因在肺癌中是一个重要的抑癌基因，具有进一步研究的价值。

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