固相萃取/液相色谱-串联质谱法测定麦卢卡蜂蜜特征化合物

郭思言，丁 涛，吴 斌，张 峰，冯 峰，刘 芸，柳 菡，张晓燕，陈 磊，邓晓军，伊雄海，杨功俊*，王雪婷

(1.中国药科大学 药学院，江苏 南京 211198；2.江苏出入境检验检疫局 动植物与食品检测中心，江苏 南京 210001；3.中国检验检疫科学研究院，北京 102600；4.上海出入境检验检疫局，上海 200135)

麦卢卡蜂蜜享有新西兰“国宝”级美誉，是蜜蜂采集当地植物麦卢卡(Leptospermunscoparium)酿成。与一般蜂蜜的抗菌活性不同，其独特的非过氧化抗菌活性(Non-peroxide antibacterial activity，NPA)[1-2]，可促进伤口愈合[3]、治疗足部溃疡[4-5]等，具有特有的药用价值[6]。我国的进口蜂蜜中麦卢卡蜂蜜占比越来越大[7]，但目前国内对于麦卢卡蜂蜜的研究较少，这对于进口麦卢卡蜂蜜的监督监管造成了很大影响。麦卢卡蜂蜜根据其抗菌活性高低进行质量评价和分级[8]，不同级别的麦卢卡蜂蜜价格差异巨大。常用丙醛酮(MGO)或二羟基丙酮(DHA)含量评价麦卢卡蜜的级别，但两者均可人为掺假，非麦卢卡蜂蜜的特征物质受温度影响较大[9-11]。Kato等[12-13]发现Leoptosperin和丁香酸甲酯是麦卢卡蜂蜜的特征化合物，且其含量与抗菌活性相关。但麦卢卡蜂蜜判定标准缺乏统一，导致蜂蜜市场鱼龙混杂。为了建立一种基于科学、准确可靠的麦卢卡蜂蜜鉴定标准，新西兰初级产业部(Ministry for Primary Industries，MPI)在2017年4月公布了能同时区分出单花种麦卢卡蜜、多花种麦卢卡蜜和非麦卢卡蜂蜜的鉴定标准[14]，最终确定2′-甲氧基苯乙酮(2′-MAP)、2-甲氧基苯甲酸(2-MBA)、3-苯基乳酸(3-PA)和4-羟基苯基乳酸(4-HPA)作为判定麦卢卡蜂蜜的指标。

MPI规定单花种麦卢卡蜜的判定标准为蜂蜜中2′-MAP、2-MBA和4-HPA的含量大于或等于1 mg/kg，3-PA的含量大于或等于400 mg/kg；多花种麦卢卡蜜为2′-MAP、2-MBA和4-HPA的含量大于或等于1 mg/kg，3-PA的含量大于或等于20 mg/kg并且小于400 mg/kg。因特征化合物具有荧光吸收，Jessie等[15]运用高效液相色谱/荧光检测器对特征化合物进行了检测，但未能确证。新西兰官方提供的特征化合物测定方法标准操作程序为“Determination of Four Chemical Characterisation Compounds in Honey by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry(LC-MS/MS),Chemistry Laboratory Method,MPI Technical - Paper No:2017/30”,该SOP于2017年10月4日生效[16]。MPI提供的方法中采用氯吡脲为内标物质，氯吡脲的扫描模式为负离子模式，以其同时作为在正离子扫描模式下待测化合物的内标物缺乏一定科学性。鉴于蜂蜜基质中富含的糖类及一些极性成分会对化合物测定造成干扰，本文对MPI方法进行改良，以便捷安全的SPE结合高灵敏度和准确性的质谱检测器为分析手段，分别对采集于新西兰不同产地的麦卢卡蜂蜜、卡奴卡蜂蜜、瑞瓦瑞瓦蜂蜜、卡玛希蜂蜜、圣诞花蜂蜜、瑞塔蜂蜜、塔瓦瑞蜂蜜等12个品种共114个巢蜜样本和来自新西兰、中国、澳大利亚、马来西亚4个国家的50个商品化蜂蜜进行了验证。根据蜂蜜品种信息结合鉴定指标要求，对实验数据结果进行了综合分析，为麦卢卡蜂蜜判定及单花种和多花种麦卢卡蜂蜜的区分提供了参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

液相色谱-Q trap 4500三重四极杆质谱仪，配ESI源(美国AB SCIEX公司)；Smart-N15VF 超纯水系统(中国力康公司)；XW-80A旋涡混合器(上海青浦泸西仪器厂)；固相萃取装置(美国Supelco公司)；Oasis HLB固相萃取柱(3 mL，60 mg，美国Waters公司)；0.45 μm尼龙微孔滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)。

2′-甲氧基苯乙酮(纯度>97%)、2-甲氧基苯甲酸(纯度>98%)、4-羟基苯基乳酸(纯度>98%)均购自东京化成工业株式会社；3-苯基乳酸(纯度>98%，英国Alfa Aesar公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；巢蜜来源于新西兰各地区，商品蜜购自各大超市。

分别称取适量2′-MAP、2-MBA和4-HPA标准品用1%甲酸乙腈溶液定容配成1.0 g/L的标准储备液。称取适量3-PA标准品配成10.0 g/L的标准储备液，于冰箱中4 ℃避光贮存；移取各标准储备液根据需要用乙腈-甲酸-水(体积比10∶1∶90)逐级稀释成标准工作液，现用现配。

1.2 样品前处理

称取1 g(精确至0.01 g)均质蜂蜜样品至50 mL带盖聚四氟乙烯离心管中，用适量1%甲酸水溶液涡旋溶解，转移溶液至50 mL容量瓶并定容(实际分析时根据蜂蜜中特征化合物含量稀释至标曲线性范围内)。准确移取10 mL蜂蜜溶液加入经3 mL甲醇活化以及6 mL水平衡后的Oasis HLB 固相萃取柱，用3 mL水淋洗，2 mL乙腈洗脱，收集洗脱液并用乙腈-甲酸-水(10∶1∶90)定容至10 mL，取1 mL过0.45 μm尼龙微孔滤膜至进样瓶，上机检测。

1.3 液质联用测定条件

1.3.1色谱条件色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)色谱柱；流动相：A为0.1%(体积分数)甲酸水溶液，B为0.1%(体积分数)甲酸乙腈溶液；流速：0.2 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.75 min，5%B；0.75～2 min，5%～15%B；2～4 min， 15%～70% B；4～6 min，70%～98% B；6～6.5 min，98%B；6.5～7 min， 98%～5%B；7～10 min，5%B。柱温：(40±2) ℃；进样体积：2 μL。

1.3.2质谱条件扫描方式：3-PA和4-HPA采用电喷雾负离子扫描模式(ESI-)；2′-MAP和2-MBA采用电喷雾正离子扫描模式(ESI+)；检测方式：多重反应监测模式(MRM)；正离子：毛细管温度500 ℃，气帘气30 psi，雾化气50 psi，辅助加热气50 psi，离子化电压5 500 V，入口电压10 V；负离子：毛细管温度500 ℃，气帘气30 psi，雾化气50 psi，辅助加热气50 psi，离子化电压-4 500 V，入口电压-10 V；4种化合物的质谱检测参数见表 1。

表1 4种特征化合物的质谱检测参数Table 1 MS/MS parameters of four chemical characteristic compounds

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

图1 4种特征化合物的化学结构式Fig.1 Chemical structures of four characteristic compounds

图2 不同稀释溶剂对特征化合物回收率的影响Fig.2 Effect of different diluted solvents on recoveries of characteristic compounds

图3 4种化合物混合标准溶液的全离子扫描色谱图Fig.3 Chromatogram of four analytes standard mixtures

蜂蜜基质含有大量糖类及部分强极性组分。糖类在洗脱时易对色谱柱造成损害，其余杂质的存在可对特征化合物的离子化产生不同程度的抑制效应。4种特征化合物均为中等极性(化学结构式如图1所示)，因此采用亲脂的二乙烯基苯和亲水的N-乙烯基吡咯烷酮聚合的HLB固相萃取柱对蜂蜜溶液进行净化，能很好地去除蜂蜜中的大量糖类化合物。

同时分析比较了水、1%甲酸水溶液、10%乙腈-1%甲酸水溶液分别作为稀释溶剂时，在麦卢卡蜂蜜中加入5 mg/kg的2′-MAP、2-MBA和4-HPA及200 mg/kg的3-PA过柱后的回收率。由图 2可知，稀释溶剂为10%乙腈-1%甲酸水溶液时，4-HPA的回收率低于50%，其余3种特征化合物的回收率为50%～70%，稀释溶剂为1%甲酸水溶液时，特征化合物的平均回收率均较高,因此，选择1%甲酸水溶液作为稀释溶剂。

2.2 色谱与质谱条件的优化

比较了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相对4种化合物峰形和保留时间的影响。结果表明，水相中加入适量甲酸有助于化合物峰形对称，加快出峰时间。有机相使用乙腈可使峰形尖锐，加入适量甲酸则可使两相混合时，流动相体系的pH值不受梯度洗脱波动，保证出峰时间的稳定。因此，选择用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

质谱分析采用最为常用的电喷雾电离源(ESI)，分别取1 mg/L的2′-MAP、2-MBA、4-HPA和10 mg/L的 3-PA标准溶液各1 mL采用流动注射泵进样，分别在正、负两种扫描模式下对目标化合物进行一级质谱全扫描。优化入口电压、去簇电压、碰撞能量等质谱条件参数后，对4种特征化合物分别选取信号强度最强、次强且干扰较少的两个离子碎片作为定量和定性离子。在优化条件下1 mg/L的2′-MAP、2-MBA、4-HPA和10 mg/L 的3-PA混合标准溶液的总离子流色谱图见图3。

2.3 基质效应的评价

考察了空白蜂蜜样本和含4种特征化合物本底的麦卢卡蜂蜜的加标回收率，结果发现，蜂蜜样本均存在不同程度的离子化抑制效应，且改变色谱条件也很难降低。MPI方法采用电离方式为ESI-的氯吡脲为内标物质，该化合物并不能对在正离子扫描模式下的化合物进行有效校正。前处理过程中进行固相萃取后发现，特征化合物的回收率明显提高，为79.4%～98.3%，能满足分析要求。因此，本实验采用固相萃取的前处理方法，有效降低了基质效应的影响，提高了方法的准确性。实验中将未进行固相萃取和固相萃取后的麦卢卡蜂蜜样品通过高分辨质谱采集m/z100～1 000范围内的离子，结果显示，固相萃取能去除强极性糖类化合物，使基质效应明显下降。

2.4 方法的线性范围、检出限与定量下限

配制质量浓度为0.01～1.0 mg/L的2′-MAP、2-MBA、4-HPA 和0.1～10.0 mg/L的3-PA的混合标准溶液，按优化后的方法进样，以各化合物峰面积(y)为纵坐标，对应的质量浓度(x，mg/L)为横坐标作线性回归。结果表明，2′-甲氧基苯乙酮、2-甲氧基苯甲酸和4-羟基苯基乳酸在0.01～1.0 mg/L、3-苯基乳酸在0.1～10.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.99。采用逐级稀释方式确定方法的检出限(LODs，S/N≥3)为0.1～1.0 mg/kg，定量下限(LOQs，S/N≥10)为0.5～5.0 mg/kg。

2.5 加标回收率与精密度

在麦卢卡蜂蜜样品中分别添加2.0、5.0、10 mg/kg 3个水平的2′-MAP、2-MBA、4-HPA和100、200、400 mg/kg的3-PA标准品，每个水平平行测定6次，外标法定量。结果表明，方法的平均回收率为79.4%～98.3%，相对标准偏差(RSD)为3.2%～8.7%(见表2)。麦卢卡蜂蜜中添加10 mg/kg的2′-MAP、2-MBA、4-HPA及200 mg/kg的3-PA标准品的各化合物定量提取离子色谱图见图4。

表2 麦卢卡蜂蜜中4种特征化合物的平均加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Average spiked recoveries and RSDs of four characteristic compounds from manuka honey at three different levels(n=6)

表3 不同方法在麦卢卡蜂蜜中4种特征化合物的加标回收率Table 3 Spiked recoveries of four characteristic compounds in manuka honey by different methods

2.6 不同方法测定值的比较

比较了MPI提供的内标方法和采用SPE前处理的外标法在麦卢卡蜂蜜中添加5 mg/kg 2′-MAP、2-MBA、4-HPA及200 mg/kg 3-PA标准品的回收率，结果见表 3。从表3可知，由于MPI选择的内标物是非同位素内标，结果缺乏一定合理性，内标不能对结果进行有效校正。

2.7 实际样品的检测

对来自新西兰不同产地的麦卢卡蜂蜜、卡奴卡蜂蜜、瑞瓦瑞瓦蜂蜜、卡马希蜂蜜、圣诞花蜂蜜、瑞塔蜂蜜、塔瓦瑞蜂蜜等共114个蜂蜜样本和来自新西兰、澳大利亚、马来西亚、中国的50个不同商品蜂蜜进行检测。结果表明，运用该鉴定指标，在新西兰114个巢蜜样本中，提供蜜种信息为单花种麦卢卡的55个蜂蜜中只有37个(67.3%)被判定为单花种麦卢卡蜂蜜，8个(14.5%)被判为多花种麦卢卡蜜，10个(18.2%)被判为非麦卢卡蜂蜜；10个蜜种信息为多花种麦卢卡蜂蜜中有8个(80%)被判定为单花种麦卢卡，1个(10%)被判为非麦卢卡蜜；17个卡奴卡蜂蜜中有4个(23.5%)被判为单花种麦卢卡蜜，13个(76.5%)被判为非麦卢卡蜜；而32个非麦卢卡蜜中有1个(3.1%)被判为单花种麦卢卡蜜，5个(15.6%)被判为多花种麦卢卡蜜。在商品化蜂蜜样本中，标识为单花种麦卢卡蜂蜜的20个样本中有15个(75%)被判为单花种麦卢卡蜜，3个(15%)被判为多花种麦卢卡蜜，2个(10%)被判为非麦卢卡蜜；2个标识为多花种麦卢卡蜂蜜的有1个(50%)判为单花种麦卢卡蜂蜜，1个(50%)判为多花种麦卢卡蜜；28个标识为非麦卢卡蜜有1个(3.6%)被判为单花种麦卢卡蜂蜜，2个(7.1%)判为多花种麦卢卡蜜。说明判定依据存在误判性，但能提供一定参考。

3 结 论

建立了固相萃取/液相色谱-串联质谱(SPE/LC-MS/MS)测定4种麦卢卡蜂蜜特征化合物的分析方法。采用改进的样品前处理方法及优化的色谱-质谱条件后，可对蜂蜜中4种麦卢卡特征化合物2′-甲氧基苯乙酮、2-甲氧基苯甲酸、3-苯基乳酸和4-羟基苯基乳酸进行准确定性和定量分析。通过对114个巢蜜样本及50个商品蜜结果进行综合分析，为判定麦卢卡蜂蜜、区分单花种和多花种麦卢卡蜂蜜提供了一定的参考依据。

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