分散固相萃取净化/高效液相色谱法测定婴幼儿奶粉与米粉中15种多环芳烃

汪晨霞，张瑞瑞，寻知庆，郭新东，黄金凤，江蓝蓝

(广州质量监督检测研究院，广东 广州 511447)

随着人们对环境和食品安全的重视，有关PAHs的研究报道越来越多。前处理方法涉及索氏提取法[6]、超声萃取法[7]、微波萃取法[8]等；测定方法包括气相色谱-质谱联用法[6]、气相色谱-串联质谱法[9]、高效液相色谱-紫外检测法[10]和荧光检测法[11]等。婴幼儿食品基质较为复杂，并且测定的PAHs组分多、限量低，需要建立提取净化效果好、检测灵敏度高的检测方法。目前已有少量使用气相色谱-质谱联用法测定奶粉或米粉的研究[3,12]。基于多环芳烃含有大共轭体系的结构特点，本文针对被EPA列为优先控制污染物的16种PAHs，选用分析灵敏度高的高效液相色谱-荧光检测法，测定了婴幼儿奶粉和米粉中PAHs的残留量。由于苊烯的荧光强度低，不适合采用荧光检测法检测，因此对其余15种PAHs进行了定性定量分析。检测方法可满足限量要求，从而为婴幼儿食品中多环芳烃残留量的风险监测[13-14]提供了一定的参考依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(Waters 2695，配2489荧光检测器)(美国Waters公司)；TurboVap LV氮吹仪(美国Caliper公司)；KQ-250DV数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；ZONKIA KDC-1044离心机(安徽中科中佳公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；JYL-C91T粉碎机(九阳公司)；MS3涡旋仪(德国IKA公司)。

试验样品：随机购买不同品牌的本地市售婴幼儿奶粉和米粉各10个。

1.2 标准溶液的配制

多环芳烃标准中间液(1 000 μg/L)：吸取多环芳烃混合标准溶液0.25 mL，用乙腈定容至50 mL。

多环芳烃标准工作液：分别吸取一定量的多环芳烃标准中间液用乙腈定容，得到质量浓度为1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/L的系列标准工作溶液。所有标准溶液均保存于4 ℃条件下。

1.3 实验方法

1.3.1样品制备奶粉样品：取200 g 样品分装于密封袋中混合摇匀，室温保存。

米粉样品：取200 g样品经粉碎机粉碎混匀，分装于密封袋中室温保存。

1.3.2样品提取奶粉样品：称取1.0 g(精确至0.001 g)样品加至50 mL离心管中，加5 mL超纯水溶解样品，涡旋均匀，再加入各为0.2 mL的亚铁氰化钾(150 g/L)和乙酸锌(300 g/L)沉淀蛋白，依次加入2 g NaCl、5 mL乙腈涡旋30 s，超声提取30 min，3 800 r/min离心2 min，取上清液至离心管中；下层残渣再用乙腈超声10 min提取2次，合并全部上清液。

米粉样品：称取1.0 g(精确至0.001 g)样品加至50 mL离心管中，加50 mg淀粉酶和5 mL温水，涡旋均匀，依次加2 g NaCl和5 mL乙腈涡旋30 s，超声提取30 min，3 800 r/min离心2 min，取上清液至离心管中；下层残渣再用乙腈超声10 min提取2次，合并全部上清液。

1.3.3样品净化在上清液中加入200 mg PSA，涡旋1 min，3 800 r/min离心2 min，取全部上清液至氮吹管中，氮吹至近干，用乙腈定容至1 mL，涡旋混匀，过0.22 μm有机系滤膜待测。

1.4 检测条件

色谱柱：Waters PAH C18液相色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；柱温30 ℃；进样量为20 μL；流速1.0 mL/min；流动相：A为乙腈，B为超纯水，梯度洗脱程序：0～3 min，50%A；3～20 min，50%～100%A；20～25 min，100%A；25～27 min，100%～50%A；27～30 min，50%A。

荧光检测器：参考文献[15-16]中一些PAHs的最佳激发及发射波长，结合不同PAHs保留时间的差异，得到荧光检测程序见表1。

表1 荧光检测程序Table 1 Fluorescence detection program

图1 15种多环芳烃标准溶液(20 μg/L)的色谱图Fig.1 Chromatogram of 15 PAHs standard(20 μg/L)1.NAP；2.ACP；3.FLU；4.PHE；5.ANT；6.FLT；7.PYR；8.BaA；9.CHR；10.BbF；11.BkF；12.BaP；13.DBA；14.BPE；15.IPY

2 结果与讨论

2.1 检测条件的优化

15种多环芳烃目标物在短时间内用液相色谱分离的难度较大，因此选用多环芳烃专用色谱柱以及梯度洗脱来达到更好的分离效果。通过对柱温、流速、洗脱条件和荧光检测程序的优化，得到了最佳的色谱分离及检测条件。此条件下30 min内所有目标物全部出峰，峰形对称、分离效果好，均能满足定性定量的分析要求，标准谱图见图1。

2.2 实验方法的优化

2.2.1样品提取方式奶粉及米粉样品基质较为复杂，考虑到多环芳烃为亲脂类化合物，而皂化反应可以减少脂类物质带来的干扰，因此本实验比较了溶剂直接提取及经50% KOH-甲醇皂化加热反应后再用溶剂提取两种前处理方式的效果。结果显示，溶剂直接提取的回收率优于皂化反应后再提取的方式。并且虽然皂化反应后样品处理较为完全，但在反应过程中引入了较多的杂质会对目标物的定性定量分析造成干扰。综上所述，溶剂直接提取方式处理时间短、杂质干扰少，因此采用该方法对样品进行提取。

图2 不同提取溶剂的回收率对比Fig.2 Recoveries comparison of different extraction solvents the PAHs numbers denoted were the same as those in Fig.1

2.2.2样品提取溶剂待测目标物数量较多，综合考虑PAHs的性质，选用正己烷、甲苯、乙腈3种低、中低、中高极性溶剂进行筛选。结果如图2所示，采用正己烷和甲苯提取，不同目标物的回收率差异较大(在12.8%～90.6%之间)，而乙腈极性中等偏大，能够很好兼顾多个目标物的性质，待测物质的提取回收率均达80%以上，能够满足检测要求，因此选择乙腈为提取溶剂。

图3 净化前后加标奶粉样品的色谱图(10 μg/L)Fig.3 Chromatograms of spiked sample before and after PSA purification(10 μg/L) the peak numbers denoted were the same as those in Fig.1

2.2.3样品净化方法为减少基质效应的影响，采用固相萃取材料对提取液进一步净化。分别选取分散固相萃取材料PSA、Florisil及HLB固相萃取柱进行净化，通过比较发现：HLB柱的回收率均不高于50%，Florisil柱净化后有5种PAHs的回收率低于40%，PSA分散固相萃取后所有目标物的回收率均大于80%。图3为加标奶粉样品使用PSA净化前后的色谱图，净化前13号化合物二苯并[a,h]蒽与某杂质的分离不完全，净化后该杂质大部分被除去。实验结果表明PSA净化效果明显，操作简单、回收率高，因此选择PSA分散固相萃取进行净化。

2.3 线性范围及检出限

采用保留时间定性，峰面积外标法进行定量。在最佳检测条件下，分别测定1.0～50 μg/L的标准工作液，绘制标准曲线。以标准工作液的质量浓度(x)为横坐标，以被测目标物的峰面积(y)为纵坐标进行线性回归计算，得到15种多环芳烃的线性回归方程，见表2。结果表明，15种多环芳烃在所测浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.995。

根据1.0 μg/L的标准工作液计算所得的信噪比(S/N)，结合前处理过程，计算得到该方法各目标物的检出限(LODs，S/N=3)为0.05～0.3 μg/kg(表2)，能够满足日常检测要求。

表2 15种多环芳烃的线性方程、线性范围、相关系数、检出限Table 2 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients and LODs of 15 PAHs

2.4 方法精密度及回收率

按最优的实验条件，选取阴性奶粉和米粉样品进行加标回收，考察方法的回收率及精密度。分别添加1.0、2.0、10 μg/kg 3个水平，每个水平平行测定6次，计算回收率的相对标准偏差(RSD)。回收率为86.5%～106.8%，相对标准偏差为0.7%～7.5%，结果如表3所示，方法的回收率和精密度均能达到检测要求。

2.5 实际样品的测定

在最优实验条件下测定了市售20种不同品牌的婴幼儿奶粉和米粉。结果显示，15种多环芳烃的检测结果均小于检出限。

表3 15种多环芳烃的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 15 PAHs(n=6)

3 结 论

本文采用高效液相色谱-荧光检测法建立了同时测定婴幼儿奶粉及米粉中作为优先控制污染物的15种多环芳烃的分析方法，并优化了检测条件、提取方法以及净化方式。方法学技术指标考察结果表明，本方法的选择性好、线性范围宽、精密度高、回收效果好、检出限低，各项指标均能满足日常检测分析要求，适用于婴幼儿食品中食品污染物多环芳烃的测定，有利于婴幼儿食品安全日常风险监测工作的开展。

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