气相色谱法测定金银花露中芳樟醇含量

马 力,张枫源,向 福,2*,丁兰草,吴 慧,何 峰,2

(1.经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室,湖北 黄冈 438000；2.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心,湖北 黄冈 438000)

金银花(Lonicera japonica),也称忍冬,药食两用的名贵中药材,用药历史悠久,具有清热解毒、疏风散热、活血化瘀之功效［1-3］,其绿原酸、木犀草素、芳樟醇等药用成分对多种疾病有良好的预防和治疗效果［2,4］,是养生保健佳品,广泛用于食品行业［5］。大别山地区金银花资源丰富,“罗田金银花”香气浓郁、挥发油含量高,2011年获批中国地理标志产品,推动了地方以金银花露加工为代表的金银花产业发展。

金银花露是一种传统的消暑解热饮品［6］,由金银花用水蒸气蒸馏提取其挥发性成分制得,为无色至淡黄色的透明液体,味微甜,气芳香,清热解毒、散热疏风［1,7］。芳樟醇是天然挥发油中分布最重要和最广泛的萜烯香料之一,有百合花或铃兰花香,是金银花发挥药理作用的主要挥发性成分［6,8-9］,不仅抗菌活性明显［10-12］,同时具有抗炎、抗焦虑、镇静催眠等保健医疗作用［13-16］,因此中国药典2015版将其作为金银花露产品质量规范控制的指标性成分,但并无其含量测定项［7,17］。

目前大别山地区金银花露产品较多,但质量参差不齐,产品中芳樟醇含量等指标有待进一步规范。近年来,金银花露产品质量逐渐引起人们关注,但产品中芳樟醇含量的报道仅限于两家企业的3批金银花露样品和一种自制山银花露样品［17-18］,缺乏代表性。因此,本研究根据中国药典2015版建立了测定芳樟醇含量的气相色谱法,并利用该方法测定了5个厂家市售不同批次的24种金银花露产品中芳樟醇含量,旨在为金银花露产品的质量控制提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗田金银花干花原料：由湖北楚天舒药业有限公司提供；乙酸乙酯、正辛醇(均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；芳樟醇对照品(CAS：78-70-6)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；A和B两家企业的金银花露不同批次样品购于当地药店和超市,C、D、E三家企业的金银花露不同批次样品由企业提供,共52个样品。

1.2 仪器与设备

Agilent GC7890A气相色谱仪配火焰离子化检测器(flame ionization detector,FID)：美国安捷伦科技公司；FA2104电子分析天平：上海精细天平有限公司；DZTW调温电热套：北京市永光明医药仪器有限公司；玻璃标准口油水分离器：科学教研玻璃仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品溶液制备

(1)内标物溶液的配制

精密量取0.5mL正辛醇至50mL容量瓶,用乙酸乙酯定容混匀后,取出1 mL溶液置于100 mL容量瓶,用乙酸乙酯定容,混匀,制得质量浓度83.0μg/mL的内标物溶液,备用。

(2)芳樟醇对照液的配制

精密量取0.6mL芳樟醇于25mL容量瓶,用乙酸乙酯定容混匀后,取出1 mL于100 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,混匀,制得质量浓度202.51μg/mL的芳樟醇溶液,取该溶液1 mL于10 mL容量瓶,乙酸乙酯定容,摇匀制得质量浓度为20.3μg/mL的芳樟醇对照液,备用。

(3)金银花露及金银花供试液的制备

按照《中国药典》2015年版的鉴别方法［7］,取金银花露饮料100 mL,置于圆底烧瓶,加氯化钠20 g和适量沸石,连接油水分离器,自分离器上端加水至刻度部分,并溢流入烧瓶为止,再加入乙酸乙酯2～5 mL,电热套加热至沸腾,保持微沸2 h,放冷后吸出乙酸乙酯层,并加入适量无水硫酸钠脱水,静置分层后,吸取上清液置于10 mL容量瓶,加入0.5 mL内标物(正辛醇)溶液,乙酸乙酯定容,摇匀即为金银花露供试液,备用。

称取干金银花样品10g置于圆底烧瓶,加氯化钠20g,连接油水分离器,按上述操作,脱水后吸取上清液置于10mL容量瓶,加入0.5 mL内标物(正辛醇)溶液,乙酸乙酯定容,摇匀即为金银花供试液,备用。

1.3.2 气相色谱法检测

对芳樟醇对照液和供试液采用气相色谱分析,所得结果用内标法计算样品中芳樟醇的含量。气相色谱条件：Agilent HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)；程序升温：初始温度为70℃,保持1 min,以3℃/min的速率升温至130℃,再以50℃/min的速率升温到250℃,维持8 min；汽化室温度：260 ℃；载气：氮气(N2),柱流速：3 mL/min；进样量1.0 μL；分流比为1∶1。

1.3.3 方法验证

(1)最小检出限浓度试验

精密量取芳樟醇对照液0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL,分别加入10 mL容量瓶,各精密加入内标物溶液0.5 mL,用乙酸乙酯稀释定容,制得芳樟醇质量浓度分别为0.04μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.41μg/mL的对照品溶液。按照1.3.2节条件进行气相色谱法分析,对比内标物正辛醇和芳樟醇的出峰情况和保留时间。

(2)线性关系试验

精密量取芳樟醇对照液0.05 mL、0.10 mL、1.00 mL、2.00 mL和5.00 mL,分别加入10 mL容量瓶,各精密量加入内标物溶液0.50 mL,用乙酸乙酯稀释定容,制备系列浓度的对照品溶液。按照1.3.2节条件进行气相色谱法分析,记录峰面积。

(3)精密度试验

取芳樟醇対照液5.0 mL,置于10 mL容量瓶,精密加入0.5 mL内标物溶液,用乙酸乙酯稀释定容。按照1.3.2节条件进行气相色谱法分析,重复进样6次,记录内标物和芳樟醇峰面积。

(4)重复性试验

精密量取芳樟醇対照液1.5 mL,置于10 mL容量瓶,精密加入0.5 mL内标物溶液,用乙酸乙酯稀释定容,平行制备7份。按照1.3.2节条件进行气相色谱法分析,记录内标物和芳樟醇峰面积。

(5)稳定性试验

精密量取2 mL芳樟醇对照液,置于10 mL容量瓶,精密加入0.5 mL内标物溶液,用乙酸乙酯稀释定容,分别在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h时间区段按照1.3.2节条件进行气相色谱法分析,记录内标物和芳樟醇峰面积。

(6)加样回收率试验

精密量取已知芳樟醇质量浓度(17.64μg/100mL)的金银花露饮料样品100mL,加入1mL芳樟醇对照液(20.3μg/mL),混匀,平行制备7份。按照1.3.1节方法提取制备供试液,并按1.3.2节条件进行气相色谱法分析,记录内标物和芳樟醇峰面积,计算加样回收率。

1.3.4 样品芳樟醇含量测定

取不同批次的52个金银花露样品(样品制备3个平行样,少数产品由于样品量不足,制备2个平行样或无平行样)和干金银花样品,按照1.3.1节方法提取制备供试液,并按1.3.2节条件进行气相色谱法分析,记录内标物和芳樟醇峰面积,根据线性回归方程计算样品的芳樟醇含量。

1.3.5 统计分析

利用EXCEL 2003和SPSS22等软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 方法验证

2.1.1 最小检出限浓度

根据图1所示气相色谱图,芳樟醇质量浓度为0.04μg/mL时,内标物正辛醇独立出峰,保留时间为5.423 min,对照品芳樟醇无信号；质量浓度0.10μg/mL时,内标物和对照品均独立出峰,且正辛醇和芳樟醇保留时间分别为5.422 min和6.175 min,分离度大于2。因此,本试验中芳樟醇最小检出限为0.10μg/mL。

图1 不同质量浓度芳樟醇的气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of linalool with different concentration

2.1.2 线性关系

确定线性关系的最低浓度不低于最小检出限,并以对照品芳樟醇与内标物正辛醇的质量浓度比(x)为横坐标,峰面积比(y)为纵坐标,拟合标准曲线(见图2),得线性回归方程为y=0.7004x-0.0089,相关系数R2=0.999 4,表明芳樟醇含量在0.1013～10.125 0μg/mL范围内线性关系良好。

图2 芳樟醇标准曲线Fig.2 Standard curve of linalool

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验

同一质量浓度的芳樟醇对照液重复进样6次,测定芳樟醇峰面积和内标物正辛醇的峰面积,结果如表1所示。由表1可知,芳樟醇与内标物峰面积比值的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.05%,表明该方法仪器的精密度良好。

表1 精密度试验结果Table 1 Results of precision tests

2.2.2 重复性试验

平行制备同一浓度的芳樟醇对照液7份,测定芳樟醇峰面积和内标物正辛醇的峰面积,结果如表2所示。由表2可知,芳樟醇与内标物峰面积比值的RSD为0.65%＜2.0%,表明该方法重复性良好。

表2 重复性试验结果Table 2 Results of repeatability tests

2.2.3 稳定性试验

供试液配制后不同时间进样,测试稳定性,结果如表3所示。由表3可知,芳樟醇与内标物正辛醇的峰面积比值RSD=1.20%＜2.00%,表明样品溶液在12 h内稳定,表明该方法稳定性良好。

表3 稳定性试验结果Table 3 Results of stability tests

2.2.4 加样回收率试验

平行制备已知芳樟醇质量浓度(17.64μg/100 mL)的金银花露样品7份,精密加入1mL芳樟醇对照液(20.3μg/mL),加样回收率计算结果如表4所示。由表4可知,芳樟醇的平均回收率为100.27%(n=7),RSD为1.62%＜2.0%,表明本试验方法准确可靠。

表4 加样回收率试验结果(n=7)Table 4 Results of adding sample recovery rate test

2.3 样品芳樟醇含量测定

内标法计算24种金银花露产品共52个批号样品中芳樟醇含量结果见表5。由表5可知,A、B、C三家生产企业的16种产品共35个样品均检测到芳樟醇,D、E两家生产企业的8种产品共17个批号样品未检出芳樟醇信号,其芳樟醇含量可能低于本方法的最小检出限为0.10μg/mL。

检测出芳樟醇信号的16种金银花露产品含量比较如图3所示。由表5和图3可知,芳樟醇含量最高和最低的产品均来自A企业,A1产品芳樟醇含量最低,为(12.30±0.72)μg/100mL,A2(国药准字)产品芳樟醇含量最高,达到(31.47±4.52)μg/100 mL,且与其他产品含量均有显著差异(P＜0.05)；其次是C企业的C7和C10两种产品芳樟醇含量较高,分别为(22.75±1.66)μg/100 mL和(22.12±2.26)μg/100 mL,且与其他产品含量差异显著(P＜0.05)；C企业8种产品和B企业4种产品的芳樟醇含量基本平稳,在14.90～18.62μg/100 mL之间。从生产企业自身看,A企业的两种金银花露产品芳樟醇含量差异极其明显,反映了两种产品作为药品和食品饮料的不同定位,但在质量控制上,两个批号的A1产品芳樟醇含量稳定,三个批号A2产品中一个批号的芳樟醇含量差异显著(P＜0.05)；B企业的B4产品也出现一个批号的芳樟醇含量差异显著(P＜0.05)；C企业的10种产品中,C6、C7、C8三种产品的不同批号均存在芳樟醇含量的显著差异(P＜0.05),其他7种产品不同批次间的芳樟醇含量则无差异(P＞0.05),质量稳定。根据表5和图3,所检测的52个批号样品中,芳樟醇含量在12.30～31.47μg/100 mL范围变动,部分企业的产品甚至未检测到芳樟醇信号,且同一产品的不同批次间芳樟醇含量指标也存在显著性差异(P＜0.05)。

表5 金银花露样品中芳樟醇含量测定结果(n=3)Table 5 Determination results of linalool contents of L.japonica distillate samples

图3 16种金银花露样品的芳樟醇含量对比Fig.3 Comparison of linalool contents among 16 kinds of L.japonica distillate samples

2.4 讨论

为深入比较金银花原料与金银花露产品中芳樟醇含量,从本地企业实地取样,测的罗田金银花干花中芳樟醇含量为(22.12±1.45)μg/g,该结果虽较万琴等［19］测定的河南、山东、江苏等产地金银花药材中芳樟醇含量低,但与何俊婷等［9］测定的山东平邑金银花芳樟醇含量相当。按大别山的罗田金银花1 g干花加工成100 mL金银花露折算(金银花原料成本低至0.1元/100 mL),该类产品芳樟醇含量应该≥22.12μg/100 mL,达到该指标值的只有A2、C7和C10三种金银花露产品。

3 结论

以正辛醇为内标物,建立了金银花露中芳樟醇含量指标测定的气相色谱法。该方法简便、准确、可靠,芳樟醇最小检出限为0.10μg/mL。利用该方法检测了大别山地区24种金银花露产品的52个批号样品,8种产品未检出芳樟醇信号,16种产品的芳樟醇含量在12.30～31.47μg/100 mL范围变化,仅3种产品100 mL剂量达到罗田金银花1 g干花的芳樟醇含量,且部分批次产品间芳樟醇含量差异显著(P＜0.05),质量不稳定。测定结果说明金银花露产品质量有待进一步规范和完善,并能以芳樟醇含量作为其质量控制的指标,从而为金银花露的质量控制提供了试验依据。

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