气质联用内标法测定饮料酒中氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯

徐跃成,王 健,艾涛波,罗 玥,刘茂坪,明红梅

(1.四川省食品药品检验检测院,四川 成都 610100；2.四川理工学院 生物工程学院,四川 自贡 643000)

氨基甲酸甲酯(methyl carbamate,MC)、氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是发酵工艺生产食品时的副产物［1］,如酒类的生产工艺过程中就会产生一定量的EC和MC。2007年国际癌症研究机构将EC定为2A类致癌物［2-3］,长期饮酒者是EC受害的高危人群［4-5］；MC也是一种致癌物质,可能诱发良性或恶性肿瘤,特别是肺癌与肝癌［6］。据文献报道,酒精性饮料中含有MC和EC的比例很高；国外已有报道在一些酒精性饮料中检出了MC和EC,许多国家都已有酒精性饮料中MC和EC相关的一些限量标准［7-8］。然而我国迄今只制定了一些单一检测食品产品中EC的方法标准,如出口酒中的EC检测方法标准,饮料酒中EC的测定地方标准以及2014年制定的食品中EC的测定国家标准［9-11］,并未制定酒类产品中MC的检测方法标准,也尚未在酒类产品中制定EC和MC的限量标准来规范企业生产,以降低食品安全系统风险和保护消费者权益［12］。鉴于酒类产品在国内有巨大的社会消费量以及可能由MC和EC带来的食品安全风险不容忽视,有必要建立有效的方法对其中的MC和EC含量进行同时测定,为制定酒类产品中MC和EC的同时测定方法标准提供方法参考,也可利用建立的方法分析MC和EC在酒类产品生产工艺过程中的产生途径,从源头降低MC和EC的引入风险。文献报道表明,使用氨基甲酸乙酯专用固相萃取柱和同位素内标法测定白酒中氨基甲酸乙酯能有较好的稳定性和回收率［13］,因此在此基础上建立同时测定酒精性饮料中MC、EC含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

二氯甲烷、乙腈(色谱纯)：美国Sigma公司；无水硫酸钠(分析纯)：成都市科龙化工试剂厂；氨基甲酸甲酯(纯度99.93%)：北京百灵威科技有限公司；氨基甲酸乙酯(纯度99.7%)：美国AccuStandard公司；d5-氨基甲酸乙酯(纯度99.6%)：加拿大CDN ISOTOPES公司；氨基甲酸乙酯固相萃取专用小柱(Cleanert EC-SPE 4 g/25mL)：美国Agela公司；白酒酒样：四川地区白酒企业生产环节抽样及市售；发酵果酒酒样：市售。

1.2 仪器与设备

Varian(CP-3800)-320MS/MS气质联用仪(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)：美国瓦里安技术(中国)有限公司；Laborota4000旋转减压蒸发器：德国heidolph海道夫公司；Dragon LabMX-S漩涡混合器：深圳良谊公司；FA2004N分析天平(感量0.000 1 g)：上海菁华公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

内标及标准储备液：确称取氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯及d5-氨基甲酸乙酯各0.050 g溶于50 mL容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,该溶液每1 mL相当于1 mg氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯及d5-氨基甲酸乙酯。

内标使用液：取d5-氨基甲酸乙酯标准储备溶液用乙腈稀释至d5-氨基甲酸乙酯含量为1 mg/L。

氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯标准使用液：取适量的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯标准溶液,用乙腈分别稀释至氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯含量为10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L。

1.3.2 气相色谱-质谱操作条件

色谱柱：VF-Wax MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)；柱温：60℃保持1 min,以5℃/min升至120℃,再以10℃/min升至240℃,保持2 min；进样口：220℃,不分流进样；接口温度：240℃；离子源温度：230℃；电子电离源(electronionization,EI)电压：70 eV；溶剂延迟时间：13 min；进样体积：1 μL；定性离子分别为EC(m/z)：62,74,89；MC(m/z)：55,59,75；d5-EC(m/z)：64,76；定量离子分别为EC(m/z)：62；MC(m/z)：75；d5-EC(m/z)：64。1.3.3样品处理方法

称取适量酒类样品于50 mL离心管中,加入d5-氨基甲酸乙酯内标溶液0.4 mL,用振荡器混匀,将离心管内样品转至氨基甲酸乙酯固相萃取专用小柱,饱和10 min,继续加入2×15 mL二氯甲烷洗脱入鸡心瓶,收集二氯甲烷液,45℃水浴减压浓缩至近干,冰水浴放置冷却,然后用2 mL乙腈溶解残渣,并加入2 g无水硫酸钠脱水,经滤膜过滤后,待上机测定。

1.3.4 样品定性与定量

定性方法：质谱仪进行测定,在扣除背景后的样品质谱图中,所选择的离子全部出现,同时所选择的离子丰度比与标准品相关离子的相对丰度一致,且波动范围在容许偏差之内。

定量方法：采用内标法定量,进样1μL标准系列中各浓度标准使用液于气质联用仪中,测定不同浓度氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯及d5-氨基甲酸乙酯的峰面积。以浓度为横坐标,测定峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线。同时进样1μL试样溶液,测定峰面积与内标峰面积的比值与标准曲线比较定量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和方法检出限

图1 MC、d5-EC、EC标准品总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of MC,D5-EC and EC standards

图2 MC(A)、d5-EC(B)、EC(C)的定性质谱图Fig.2 Qualitative mass spectrum of MC(A),d5-EC(B)and EC(C)

使用内标法定性及定量,以质量浓度(μg/L)为横坐标(X),MC、EC与d5-EC的峰面积相对比值为纵坐标(Y),得到的线性方程在10～400μg/L范围内线性关系良好,EC的线性方程为Y=0.003 9X-0.075,相关系数R2=0.999 4；MC的线性方程为Y=0.0013X-0.0227,相关系数R2=0.9961。相同色谱条件下,参照SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法气相色谱-质谱法》的EC检出最低限值,以4 mL的50%vol白酒阴性样为加标样进行检出限考察(n=6),MC和EC加标量均为0.04μg/4 mL,按1.3.3对其进行前处理并上机测定,得到本方法的检出低限：MC、EC均为10μg/L(MC的相对标准偏差(relativestandard deviation,RSD)≤4.6%,EC的RSD≤0.9%),在检出限浓度水平回收率良好,均为110%。

2.2 方法加标回收率及精密度

以50%vol白酒阴性样(本底含量为0)为加标样,取样量4 mL,选取标准曲线中间点浓度对其进行添加回收试验,MC的回收率加标量为0.4μg/4 mL(即100μg/L),EC的回收率加标量0.2μg/4 mL(即50μg/L),参照1.3.1对其进行前处理,结果见表1。MC和EC的精密度考察质量浓度为200μg/L,分别平行测定6次,结果见表2。

表1 MC和EC加标回收率试验结果(n=6)Table 1 Adding standard recovery rate tests results of MC and EC

由表1可知,该方法MC回收率为103%～108%,RSD=0.50%；EC回收率为96%～104%,RSD=3.79%；说明该方法准确度良好。

表2 MC和EC精密度试验结果(n=6)Table 2 Precision tests results of MC and EC

由表2可知,该方法MC含量测定结果RSD=3.0%,EC含量测定结果RSD=2.0%,结果表明该方法精密度高。

2.3 酒精性饮料中MC和EC的检出情况

2.3.1 白酒中的MC和EC的检出情况

169个白酒抽检样品的EC检出情况统计见表3。

表3 白酒中EC检出情况统计(n=169)Table 3 Statistics of EC detection in Baijiu

由表3可知,EC未检出4批次,占总比例2.4%,均为液态酒及液态勾兑白酒。结合样品工艺和原料类型来看,总体检测数据结果与国际、国内文献报道［4,8］的数据基本相符,也符合从其产生机理预期的检测结果。

本实验检测全部批次白酒中的MC全部未检出。其原因结合前述MC的产生机理及本项目抽取的白酒生产原料来看,应该是所抽酒样工艺过程中MC的前体物质甲醇或氰化物［6］产生量很低,导致MC合成量低,因此产品中MC浓度很低。

2.3.2 发酵果酒的MC和EC检出情况

表3 发酵果酒中MC和EC检测结果Table 3 Detection results of MC and EC in fermented fruit wine μg/L

由发酵果酒EC、MC检测结果(表4)可见,果酒中EC含量平均值为16μg/L；MC的检出平均值为300μg/L,原因可能是该系列果酒发酵液中较白酒含有更高浓度的MC前体物质利于MC的合成所致。

3 结论

采用固相萃取方式对酒精性饮料样进行前处理,使用D5-氨基甲酸乙酯同位素内标GCMS法同时测定其MC、EC含量,结果表明,在10～400μg/L范围内,EC的线性相关系数为0.999 6,MC的相关系数为0.996 1,二者检出限均为10μg/L,MC加标回收率为103%～108%,RSD为0.50%；EC加标回收率为96%～104%,RSD为3.79%；方法准确性良好。MC含量测定结果RSD为3.0%,EC含量测定结果RSD为2.0%,方法精密度良好。抽样检验结果表明,白酒中未检出MC,其他酒精性饮料均含有一定量的MC和EC。

从本实验检测结果及相关文献报道［4-7,9,12-13］可知,白酒及其他酒精性饮料中EC和MC均具有较高的检出比例和较高的检出含量,鉴于EC和MC复杂的形成机理和途径［14-18］,建议相关监管机构完善白酒及其他酒精性饮料中EC、MC的风险监测体系,将尿素、氰化物、甲醇等前体物质［19-21］与EC、MC含量一起纳入风险监测,为厂家控制和减少EC、MC的引入提供方法建议,从本源上完善酒中EC、MC的风险监测体系,获得更加确凿的数据证据,以确保酒类的生产、加工和储存过程更加的规范而安全［22］,尽快的制定出我国相应的限量标准。

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