气相色谱-质谱联用法测定葡萄酒中三种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精

2018-05-10陈丹萍朱克卫谢应新杨富春

中国酿造 2018年4期

陈丹萍,朱克卫,谢应新,杨富春

(1.佛山出入境检验检疫局,广东佛山 528000；2.黄埔出入境检验检疫局,广东广州 510730)

葡萄酒作为上佳饮品,受到越来越多人的喜爱,它含有大量的生物活性物质［1］,对抗氧化、预防衰老、预防冠心病等有很好的作用［2-4］。葡萄酒的质量安全一直是人们关心的问题,但葡萄酒市场存在以次充好,甚至制假售假等非法行为［5］。出现劣质葡萄酒的原因主要有：一是劣质的葡萄原材料；二是葡萄酒在加工和包装前为了节约成本加水稀释,使葡萄酒口味变得平淡,于是个别生产企业就向葡萄酒中添加各种添加剂［6］(如合成着色剂、甜味剂、葡萄香精等),弥补葡萄酒的口感和香气［7-8］。其中葡萄香精是一种食用香精,由2种或2种以上的香料和助剂按一定的比例制成的葡萄味的香料混合物。葡萄香精的主要成分是邻氨基苯甲酸酯类,其中包括邻氨基苯甲酸甲酯、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸乙酯,然后再辅以酒香、玫瑰花香、糖甜香,配以酯类果香而成［9-10］。据资料报道,邻氨基苯甲酸酯类一般存在于甜橙、柠檬、葡萄等水果的芳香组分中,葡萄酒中只有美洲葡萄及其杂交品种酿制的葡萄酒才含有邻氨基苯甲酸酯类,而欧洲葡萄品种未见有关邻氨基苯甲酸酯类的报道［12-13］。

国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》中明确规定葡萄酒中不得添加任何香精,否则被视为不合格产品［11］。但我国暂没有葡萄酒中邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精检测的相关标准方法。因此,有必要对葡萄酒中邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精进行检测分析。

气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法在食品分析中迅速发展［14-16］,保证了质谱分析结果的稳定性和准确性。本研究建立了简单、快捷、准确的葡萄酒中邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的检测方法,为辨别葡萄酒的真假提供了有力的手段,有助于有关部门对葡萄酒进行更加全面的监管,保障食品的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用葡萄酒：市售。乙醇、正己烷(均为色谱纯)：德国默克公司；氯化钠(分析纯)：广州化学试剂厂；C18吸附剂、N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)吸附剂：安捷伦科技有限公司；邻氨基苯甲酸甲酯(纯度≥99%)、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯(纯度≥98%)、邻氨基苯甲酸乙酯(纯度≥99%)：美国Alfa Aesar公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂；HY-BⅡ涡旋振荡器：上海琪特分析仪器有限公司；QT-1回旋振荡器：江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确量取10.0 mL葡萄酒样品于50 mL离心管中(起泡葡萄酒常温超声30 min脱气后再取样),用10 mL正己烷进行提取,涡旋2 min,再置入振荡器中振摇10 min,充分混匀后以4 000 r/min离心5 min,吸取上层有机层于另一离心管中(若分层不明显,则加入少量氯化钠,使其下层饱和),再重复提取一次,合并上清液,于水浴温度40℃条件下在氮吹仪上氮吹,浓缩至＜0.5 mL,用无水乙醇溶解残渣并定容至1.0 mL,过0.2μm微孔滤膜,供上机分析。

1.3.2 气质联用法分析条件

气相色谱条件：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)。程序升温：初始温度70℃,以5℃/min升至160℃,再以20℃/min升至260℃,后运行280℃。进样口温度280℃,辅助通道温度280℃,氦气流速1 mL/min,进样量1μL,进样方式：不分流进样。

质谱条件：离子源温度230℃,四极杆温度150℃,电离方式为电子电离(electronic ionization,EI)源,质谱扫描方式为选择离子监测(selectionmoniring,SIM),定量离子、定性离子及丰度比分别为邻氨基苯甲酸甲酯离子：119(100)：151(61)：92(59)：65(33)、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯离子：165(100)：105(93)：104(88)：77(64)、邻氨基苯甲酸乙酯离子：119(100)：165(52)：92(44)：120(34)。

1.3.3 标准溶液的配制

单标储备液配制：分别准确称取3种标准品邻氨基苯甲酸甲酯、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸乙酯10 mg(于3个100 mL容量瓶中,用乙醇溶解并定容至刻度,配制成100 mg/L的标准储备液,储存于-18℃冰箱中备用。

混合标准储备液配制：各取1.0mL上述标准储备液,用乙醇定容至10 mL,配制成10 mg/L的混合标准储备液。

混合标准工作液配制：将上述混合标准储备液用乙醇稀释成0.05mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L、1.00mg/L混合标准系列溶液,现用现配。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

葡萄酒基本成分有水、醇、糖、酸、单宁、多酚,还含有丰富的氨基酸、维生素C、矿物质及多种微量香味成分,其中水作为溶剂占主要体积,属于极性溶剂；邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精属于弱极性溶质,因此选用非极性或弱极性的有机溶剂才能对葡萄酒样品中的邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精进行提取。一般实验室可选择的非极性、弱极性有机溶剂有二氯甲烷、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、乙醚、苯、甲苯等。苯和甲苯毒性较强,考虑到实验人员安全和对环境的影响,本实验暂不考虑将其作为提取溶剂；二氯甲烷密度大,萃取后有机层在下层,吸取有机层进行浓缩时操作不便,误差较大,因此不考虑二氯甲烷作为提取溶剂；乙醚、乙酸乙酯萃取葡萄酒时,提取葡萄香精的同时还提取了少量的色素,需考虑进一步净化有机层的步骤,将前处理复杂化,因此也不考虑乙醚、乙酸乙酯作为提取溶剂；石油醚、正己烷作为提取溶剂具有操作简便,分层明显,提取效果好等特点。以干红葡萄酒为样品基质,石油醚、正己烷作为提取溶剂,分别进行不同加标水平的回收实验,结果见图1。由图1可知,两种提取溶剂都具有良好的回收率,正己烷提取的整体回收率比石油醚的要高。因此,最终选用正己烷作为本实验的提取溶剂。

图1 两种提取溶剂对干红葡萄酒中邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精不同加标水平提取效率的影响Fig.1 Effects of two extraction solvents on the extraction efficiency of anthranilates grape essence at different spiked levels in dry red wine

2.2 净化方式的选择

本次实验对于液-液萃取净化方式和分散固相萃取结合液-液萃取净化方式进行了比较,液-液萃取净化方式是在液-液萃取浓缩定容后不再净化,直接上机。而分散固相萃取结合液-液萃取净化方式是在液-液萃取浓缩定容后再加入无水硫酸镁、C18和PSA进行净化,净化后再上机。

加入无水硫酸镁、C18和PSA的量分为两组,一组为0.2 g无水硫酸镁、0.1 g C18、0.1 g PSA；另一组各质量减半,为0.1 g无水硫酸镁、0.05 g C18、0.05 g PSA,选用有代表性的干红葡萄酒作为样品,进行分散固相萃取加标回收测试。

结果表明,加入分散固相萃取净化剂后回收率时高时低,加入净化剂的量也会影响回收率,特别是邻氨基苯甲酸甲酯,加入净化剂量较大会导致回收率偏高。对比分散固相萃取前后选择离子色谱图,样品的背景没有明显的改变。而液-液萃取比分散固相萃取更加简便、经济,不经过分散固相萃取也能得到很好的色谱图,且回收率符合要求,所以本实验的净化方式选择液-液萃取。

2.3 色谱条件的优化

图2 三种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精混标(A)及加标样品(B)的色谱图Fig.2 Chromatogram of three O-aminobenzoic acid esters grape essence mixed standard(A)and adding standard samples(B)

邻氨基苯甲酸酯类3种葡萄香精属于弱极性化合物,通过对2种相同规格不同极性的色谱柱DB-17MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)和HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)的对比使用,最终选用固定相为5%苯基-甲基聚硅氧烷的HP-5MS石英毛细管柱。

调整程序升温的升温速率和保持时间,最终选择了初始柱温70℃,以5℃/min升至160℃,再以20℃/min升至260℃,后运行280℃进行GC分离。

流速分别选择了0.5 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min进行测试,其中1.0 mL/min能使三个目标峰完全分开,响应值较高,分离度最好,峰形尖锐且对称。

2.4 三种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的测定

三种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精混标及加标样品气相色谱质谱图见图2。

由图2可知,邻氨基苯甲酸甲酯出峰时间为12.359min；N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯出峰时间为14.028min；邻氨基苯甲酸乙酯出峰时间为14.177 min。在最佳色谱条件下,3种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精能够较好地分离。

2.5 质谱条件的优化

首先采用单一标准品进样,在全扫描模式下,分别获得3种葡萄香精的总离子流色谱图,确定目标物的保留时间,扣除本底后,根据对全扫描质谱图的分析,确定目标物的特征离子及离子间的比值。

3种葡萄香精分子质量分别为151.06(邻氨基苯甲酸甲酯)、165.08(N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯)、165.08(邻氨基苯甲酸乙酯),对上述全扫描质谱图碎片离子进行分析,考虑到碎片离子的特异性、排除基质杂质离子干扰、定性定量离子的数量等因素,本实验选用4个特征离子进行定性,其中一个响应值最高离子进行定量,如表1所示。

根据优化好的质谱条件及定性定量离子,采用选择离子监测(SIM)扫描模式,进一步提高灵敏度,改善峰形和精密度,满足痕量分析的要求。

表1 三种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的保留时间、定量离子、定性离子Table 1 Retention time,quantitative ions and qualitative ions of three O-aminobenzoic acid esters grape essence

2.6 线性范围和方法定量限

将配制的混合标准系列溶液0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L进行气相色谱-质谱分析,以标准工作溶液中各葡萄香精的浓度为横坐标,定量离子提取色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得到线性方程结果见表2。由表2可知,3种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精在0.05～1.00 mg/L范围内,呈现良好的线性关系(相关系数R2值均＞0.998)。在空白样品中添加低浓度的混合标准工作溶液,进行前处理后上机检测,按10倍信噪比得到3种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的方法定量限均为5μg/L。

表2 三种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的线性方程、相关系数及方法定量限Table 2 Regression equation,correlation coefficients and method limits of quantification(LOQs)of three O-aminobenzoic acid esters grape essence

2.7 加标回收率和精密度

以干红葡萄酒空白样品加标方法进行准确度和精密度实验,添加水平为5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L,每个水平重复测定6次,结果见表3。由表3可知,3种香精的平均回收率分别为90.3%～99.3%、86.2%～102.4%、90.8%～101.1%；精密度试验结果相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为1.02%～8.75%、1.44%～7.55%、2.33%～6.56%,该方法精密度良好,准确性可靠。

表3 3种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的加标回收率和精密度实验结果Table 3 Results of adding recoveries rate and precision experiments of three O-aminobenzoic acid esters grape essence

2.8 实际样品的测定

收集312个葡萄酒样品作为研究对象,依次编号为#001、#002、……、#312。样品包含了不同色泽(红葡萄酒、白葡萄酒、桃红葡萄酒),不同含糖量(干葡萄酒、半干葡萄酒、半甜葡萄酒、甜葡萄酒),不同二氧化碳含量(平静葡萄酒和起泡葡萄酒),不同国家(包括新世界葡萄酒和旧世界葡萄酒,具体国家有中国、西班牙、意大利、葡萄牙、法国、德国、澳大利亚、新西兰、美国、智利、阿根廷、南非),样品具有一定的代表性。

在312个葡萄酒样品中,被检出邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的有13个,占总样品数的4.2%,其中,检出邻氨基苯甲酸甲酯有5个,含量分别为31.07μg/L、35.35μg/L、7.03μg/L、210μg/L、6.02μg/L,检出邻氨基苯甲酸乙酯有8个,含量分别为5.47μg/L、7.77μg/L、5.37μg/L、5.10μg/L、7.20μg/L、5.18μg/L、7.17μg/L、5.25μg/L,检出N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯,出峰时间为12.359 min,含量为6.05μg/L。实际样品中检出邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的原因可能是：美洲葡萄及其杂交品种酿制的葡萄酒含有邻氨基苯甲酸酯类；不法商家以次充好而违法添加了邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精。

3 结论

本研究建立了气相色谱-质谱联用法测定葡萄酒中邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的检测方法。结果表明,该方法定量限为5μg/L,3种邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精在0.05～1.00 mg/L范围内呈现良好的线性关系,相关系数R2值均＞0.998,样品加标平均回收率为86.2%～102.4%,精密度试验结果相对标准偏差为1.02%～8.75%。该方法简便、快速、准确、灵敏,具有良好的精密度及准确性,可用于葡萄酒中邻氨基苯甲酸酯类葡萄香精的测定。

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