老年痴呆模型中人参皂苷Rg1预处理对大鼠脑片中突触素表达的影响*

李明 李玺 权乾坤 袁海峰 徐阳

(1.西安交通大学第二附属医院, 陕西 西安 710004；2. 西安市第五医院, 陕西 西安 710083)

老年性痴呆是一种常见于老年人的神经退行性变性疾病。有研究表明，老年大鼠海马突触数量和突触素(Synaptophysin,SYN)表达明显减少[1]，在老年痴呆患者早期即可出现突触的丧失，其认知障碍程度与突触结构和功能的改变密切相关。因此，突触的病理性重构是老年性痴呆认识障碍的重要病理基础[2-4]。研究表明，老年大鼠脑内突触素丢失程度与记忆缺失程度呈正相关[5]。

人参皂甙Rg1是人参“益智延年”的主要成分, 其主要的靶器官是中枢神经系统。近年来，人参皂苷Rg1对神经保护、增强记忆和抗衰老作用方面的研究已取得了一定进展[6]，已成为研究中药抗痴呆的热点之一。研究发现，人参皂甙Rg1对多种实验动物模型的学习记忆障碍均有明显的改善作用，其作用机制可能与提高胆碱能功能，促进M-胆碱受体数量明显增加、促进受体蛋白合成有关[7]。人参皂甙Rg1还有抗氧化，清除自由基，抗衰老和抑制细胞凋亡的作用[8-10]。但是目前关于人参皂甙Rg1对SYN表达是否有上调作用并不清楚。因此,本实验采用冈田酸(okadaic acid，OA)制备老年痴呆大鼠脑片模型，观察人参皂苷Rg1对老年痴呆模型大鼠脑片中SYN表达的影响，旨在阐明人参皂苷Rg1能否通过影响突触素的活性表达，发挥抗老年性痴呆神经退行性变的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择体重110～130g雄性 SD大鼠,5周龄，清洁级，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号为SCXK(陕)2007-001。实验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导意见》。

1.1.2 主要仪器 光学显微镜，日本OLYMPUS公司产品，型号：BH22；冰冻切片机，德国MICROM公司产品，型号：HM500；振动切片机，上海之信仪器有限公司产品，型号：ZQP-86；图像处理与分析系统，德国LEICA公司产品，型号：Qwin550CW。

1.1.3药物与试剂 人参皂苷Rg1购自吉林宏久生物科技股份有限公司，分子式为C42H72O14,化学结构式见图1，纯度98.99%，使用前溶于分析纯甲醇。OA购自美国ALEXIS生物制剂公司，纯度98%，使用前溶于10% 二甲基亚砜(dimethy sulphoxide, DMSO)，配制成1 mg/mL二甲亚砜溶液待用。SYN蛋白兔抗鼠多克隆抗体、免疫组化试剂盒(SABC)及DAB均为北京博奥森生物技术有限公司产品。Haws’S苏木素由西安交通大学医学实验中心提供。

图1 人参皂苷Rg1分子结构示意图Figure 1 The chemical structural formula of Gensenoside Rg1

1.2 方法

1.2.1 脑片制备 配置人工脑脊液(成分：mmol·L-1)(150 NaCl，2 CaCl2，1.2 MgSO4，0.5 KH2PO4，1.5 K2HPO4，10 glucose，pH7.4) ，取5周龄SD大鼠，参照文献方法[11]，大鼠经6%水合氯醛麻醉后，断头取脑，快速置于0～4 ℃的人工脑脊液冰水混合物中，振动切片机以振幅8档，速度3档行冠状切片所切脑片含皮层和海马，平均厚度400μm。挑选形态较好(含海马和皮层)的脑片置入盛有人工脑脊液的6孔板中培养，温度(32.0±0.5)℃，整个过程人工脑脊液中持续通入混合氧气(95%O2+5%CO2)。

1.2.2 分组及干预 脑片随机分为5组：空白组、模型组、人参皂苷Rg1低、中、高浓度组，每组10张脑片。人工脑脊液孵育1小时，人参皂苷Rg1各组分别加入人参皂苷Rg1(60 μmol·L-1、120 μmol·L-1、240 μmol·L-1)培养2 h，模型组和人参皂苷Rg1各浓度组分别加入OA(1 μmol·L-1)培养3 h后，固定处理。

1.2.3 脑片SYN表达检测 标本经4%多聚甲醛固定4 h，取出，转入30%蔗糖溶液浸泡至沉底，做冰冻切片，切片10μm厚，每张切片含皮层、海马、齿状回。然后进行免疫组织化学染色，组织切片经抗原修复, 3% H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min, 兔抗大鼠SYN浓度为1:600, 4℃过夜,生物素标记的单克隆小鼠抗兔IgG即用型二抗和SABC试剂各在室温下作用30 min, 链酶亲和素-过氧化物酶复合物进行抗原修复，最后DAB显色,苏木素轻度复染, PBS代替一抗做阴性对照。

1.2.4 图象分析 采用图象处理与分析系统，检测阳性反应物质的平均灰度值，每张切片同一区域中，随机选取6个视野，检测面积相同，取其平均值作为该切片目标区域的平均灰度值。灰度值越低，蛋白表达量越高，反之灰度值越高，蛋白表达量越低。

2 结果

SYN的阳性免疫反应物质为棕黄色，主要分布于细胞的突触、胞膜和胞浆，胞核不着色或着色淡。本实验中，大鼠脑片经冈田酸孵育后，模型组与空白组比较，SYN的阳性细胞表达量明显减少(P<0.05)。经人参皂苷Rg1干预后检测脑片SYN的阳性细胞表达变化发现，与模型组比较，各浓度药物组SYN的阳性细胞表达量均有增加(P<0.05)，其中低剂量组与中剂量组在CA1和Cortex之间比较差异有统计学意义(P<0.05)，同时在各脑区人参皂甙Rg1高剂量组SYN的阳性细胞表达明显优于人参皂甙Rg1中、低剂量组，存在一定的剂量依赖关系，见表1、图2。

表1 人参皂甙Rg1对老年痴呆模型大鼠脑片SYN的影响(灰度值)Table 1 Expression of SYN protein in rat brain slices in different groups

注：与空白组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05；与高剂量组间比较，③P<0.05；与中剂量组比较，④P<0.05

图2 免疫组织化学法检测各组大鼠脑片皮层区SYN蛋白阳性细胞表达(光学显微镜，×400)Figure 2 Expression of SYN protein in cortex in different groups observed by immunohistochemical method注：A. 空白组； B. 模型组； C. 人参皂甙Rg1高浓度组

3 讨论

突触素是突触小泡中含量最多的特异性膜通道蛋白，在所有的神经末梢内几乎都有分布,是神经元和神经内分泌细胞的一种特异性标记物。它在突触囊泡的导入、转运、再循环和神经递质的释放及突触的发生和发育，以及突触的可塑性中都具有非常重要的作用，是学习记忆过程中的重要蛋白[12-13]。突触素分布数量和密度可间接反映突触的数量和密度[14]。突触丧失将会引起严重的认知障碍,学习记忆功能受损[15]。因此，免疫组化图像采集及数据分析能反映神经元突触变化状况。本实验将冈田酸加入培养大鼠脑片的ACSF中结果发现,与空白组比较,模型组SYN蛋白阳性表达细胞量下降(P<0.05) ,推测可能是冈田酸造成大鼠脑片神经元变性坏死,导致轴突终末变性、丢失，突触数量及突触素表达的降低，这与文献报道一致[16]。

人参皂苷 Rg1 作为人参促智作用的主要有效成份之一，对 AD 具有多种神经保护作用[17-21]。目前还未有研究证实人参皂苷 Rg1 是否可以通过上调脑内SYN表达在突触的可塑性中起一定的作用。本实验在ACSF中首先加入人参皂苷Rg1预处理2 h,然后再加入冈田酸,结果发现,人参皂苷Rg1各组脑片SYN蛋白的阳性细胞表达较模型组显著提高(P<0.05)。这说明人参皂苷Rg1可能通过对抗冈田酸对SYN的抑制作用, 上调SYN的蛋白表达水平，且表达随剂量的增加而增加,人参皂苷Rg1药效作用呈一定的剂量依赖关系。

总之，人参皂苷 Rg1对OA所致AD大鼠脑片有明显的干预作用,这种作用可能与人参皂苷 Rg1提高脑片突触素的阳性表达、增加神经元保护有关，具体机制还有待进一步探讨。

4 结论

本文结果显示，以OA诱导大鼠脑片tau蛋白发生磷酸化，制备AD样tau蛋白磷酸化大鼠脑片模型，经人参皂苷Rg1预处理后，SYN的阳性细胞表达明显增加且呈剂量依赖关系。由此可见，人参皂苷Rg1通过上调脑内SYN的表达，增加神经元保护，以此发挥抗痴呆作用。

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