豆浆中皂甙的提取及测定

乔兆扬，曹 慧，徐 斐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)

豆浆中皂甙的提取及测定

乔兆扬，曹 慧*，徐 斐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)

大豆皂甙具有众多对人体有益的生理功能和生物活性，决定了它具有广泛的开发价值和应用前景。采用乙醇、正丁醇提取豆浆中皂甙，并通过香草醛法测定其含量，探讨了提取温度、提取时间、豆浆与乙醇的配比及水饱和正丁醇的用量对豆浆中皂甙含量的影响。确定豆浆中大豆皂甙最优提取工艺条件:反应时间为3h，豆浆与乙醇配比为1∶5，水饱和正丁醇为90mL，反应温度为75℃，此条件下，每100mL豆浆中皂甙含量为89.668mg。

大豆皂甙，比色法，提取

Abstract:Soyasaponin has wide development and applicative prospect due to its beneficial physiological functions and biological activities for people.The saponins in soybean milk can be extracted using ethanol and butanol and detected by vanillin.The effects of the temperatures，times，the ratio of soybean milk to alcohol and the saturation of normal butanol on extraction were investigated.The results suggested that the optimum extraction conditions were temperature for 75℃，the time for 3h，the mass ratio of soybean milk to alcohol for 1∶5 and the volume for butanol at 90mL.In this condition，the concentration for soyasaponins was 89.668mg per 100mL soybean milk.

Key words:soyasaponin;colorimetric determination;extraction

豆浆是大豆经过研磨后与水混合而成的乳白色饮品，因其营养丰富，口感好，越来越受到人们的青睐。豆浆中除了含有丰富的优质蛋白质及多种人体所需的微量元素，还富含不饱和脂肪酸、大豆皂甙、异黄酮等几十种对人体有益的物质，在降低人体胆固醇，防止高血压，增强机体免疫力和抗肿瘤等方面［1－3］具有很好的功效。其中大豆皂甙是一种具有广泛应用价值的天然生物活性物质，已经普遍应用于医药、食品、化妆品、饲料等行业中［4］。豆浆中的皂甙属于三萜类齐墩果酸型化合物，是三萜类同系物的羟基和糖分子环状半缩醛上的羟基失水缩合而成［5］。豆浆中皂甙含量的准确测定对于豆浆的加工工艺具有重要的指导意义，目前测定皂甙的方法主要有比色法、高效液相色谱法等。比色法因其方便快捷而被广为应用，但对其前处理条件即豆浆中皂甙的提取一直缺乏系统完整的研究，在一定程度上制约了其应用，故采用比色法来测定豆浆中皂甙的含量并对其提取条件进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙醇(75%)、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯 上海高信化波仪器有限公司，分析纯;乙醚、正丁醇、无水甲醇、香兰素 国药集团化学试剂有限公司，分析纯;齐墩果酸标准品(纯度＞99%) 国药集团化学试剂有限公司，色谱纯。

DX－SZ4电热恒温水浴锅 上海华连医疗器械有限公司;N－1000旋转蒸发仪 EYELA;SHZ－88台式水浴恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂;722S分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂配制方法

1.2.1.1 齐墩果酸标准溶液的配制 精确称取齐墩果酸10mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制得浓度为0.2μg/μL的标准溶液，摇匀，备用。

1.2.1.2 水饱和的正丁醇与正丁醇饱和的水的配制

取60mL正丁醇和40mL水充分混合，静止分层，上层为水饱和的正丁醇，下层即为正丁醇饱和的水。

1.2.2 大豆皂甙的提取 称取30.00g大豆，洗净，加入150mL水浸泡12h，用滤网滤干大豆表面水分，并称重。称量好的大豆放入料理机，加入500mL水打磨，再用4层过滤网过滤。量取20mL豆浆滤液，以1∶5的比例加入75%的乙醇100mL，于80℃恒温水浴锅中提取5h。对提取液过滤，取滤液60mL置于旋转蒸发瓶中，在旋转蒸发仪上蒸干，加入去离子水10mL溶解，并转移入分液漏斗中，用40mL乙醚分两次进行脱脂，取下层、上层收集液加入10mL去离子水洗涤，弃去醚层，取下层，与之前下层合并。然后用水饱和过的正丁醇60mL分3次萃取，取上层，再用20mL正丁醇饱和的水洗涤萃取液，去上层，移入旋转蒸馏瓶，于旋转蒸发仪上挥干正丁醇后，用甲醇定容至10mL，备用。

1.2.3 影响大豆皂甙提取的单因素分析 根据相关资料报道及前期预实验的结果表明，水浴提取的时间、温度、豆浆与乙醇的配比、水饱和的正丁醇的使用量都是影响豆浆中皂甙制备的主要因素。因此以豆浆中皂甙含量为评价依据，考察提取时间、温度、乙醇的浓度以及水饱和正丁醇的用量对皂甙提取的影响。

1.2.4 大豆皂甙提取条件的优化 通过对单因素实验的结果分析，确定以提取时间、提取温度、豆浆与乙醇的配比以及水饱和的正丁醇用量作为主要因素，并且以豆浆中皂甙提取量为评价指标，设计四因素四水平正交实验。选用L16(45)正交设计表进行实验，确定最佳提取条件。实验因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.2.5 比色法测定大豆皂甙的含量 吸取已制备的皂甙100μL于试管中，放入60℃恒温水浴振荡器中挥去甲醇，分别在实验管和空白管加入香草醛－冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL。加盖置于70℃水浴反应15min。反应完毕后，立即放入冰水中冷却2min，再分别加入5mL乙酸乙酯。混匀后，在558nm［6］处测定吸光值，根据标准曲线计算豆浆中皂甙的含量。

2 结果与讨论

2.1 香草醛法测定豆浆皂甙及标准曲线的绘制

采用香草醛法对皂甙进行定量测定时，香草醛－冰醋酸浓度、高氯酸用量、反应时间和反应温度都是影响吸光值不可忽视的因素，因此本实验采用预实验确定最佳的反应条件并对其进行测定。

采用齐墩果酸作为标准品，准确吸取0、100、200、300、400、500、600μL 齐墩果酸标准溶液置于10mL具塞试管中，于60℃水浴中挥去甲醇，加入新配制的香草醛－冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL摇匀，70℃水浴保温15min，取出后立即用冰水冷却，加入5mL乙酸乙酯，摇匀。以不加标准品的溶液为空白，558nm处测定吸光值。以吸光值和齐墩果酸浓度作图，得到回归方程:y=0.0013x－0.0073，R2=0.9987。如图1所示。

图1 齐墩果酸标准曲线的绘制

2.2 水浴时间对皂甙提取量的影响

由图2可见，提取液中皂甙含量随着提取时间的增加呈先增大后降低的趋势，在提取时间为5h时浓度最高。在提取时间为1h时，由于提取时间不足，萃取不够充分，因此提取液中皂甙含量偏低。而如果水浴时间达到7h，提取液中皂甙含量则呈下降的趋势，这可能是因为长时间的高温反应，会使豆浆中皂甙的活性成分发生降解，故而提取出的皂甙含量降低。即最佳的提取时间为5h。

图2 时间对提取皂甙含量的影响

2.3 水浴温度对皂甙提取量的影响

由图3可知，在初始升温阶段皂甙含量随着提取温度的增加呈现上升的趋势，但当水浴温度达到90℃时，皂甙含量明显降低。这可能是因为随着温度的升高，一开始温度会对皂甙的提取起促进作用，当提取温度超过80℃后会对豆浆中的活性成分——皂甙造成破坏，使其发生分解，所以皂甙含量会呈现急剧下滑的现象。即80℃为最佳提取温度，此时的皂甙提取量最高。

图3 温度对提取皂甙含量的影响

2.4 豆浆与乙醇的配比对皂甙提取量的影响

由图4可知，皂甙含量随豆浆与乙醇的配比的增加成均匀上升趋势，当豆浆与乙醇的配比达到1∶7的时候，皂甙含量的增加趋势趋于平缓。当乙醇的量不充分时，未能充分提取豆浆中的活性物质，而且提取液也不够澄清，呈浑浊、多悬浮物状。即确定最佳的豆浆与乙醇的配比为1∶5。

2.5 水饱和正丁醇的用量对皂甙提取量的影响

由图5可知，提取液中皂甙含量随着水饱和正丁醇用量的增加而增加，用量越多，萃取的皂甙含量越大，萃取也越充分，但随着其萃取用量进一步增加，提取液中皂甙含量的增加逐渐趋于平缓。正丁醇萃取法是将脱了脂的豆浆用乙醚萃取过后，用水饱和的正丁醇萃取，静置，皂甙主要留在正丁醇相中，故水饱和正丁醇的用量越多，所萃取出的包含在正丁醇相中的皂甙含量就越多。当水饱和正丁醇用量超过90mL时，对提取液中皂甙含量的影响就不显著了。

表2 正交实验结果与极差分析

表3 正交实验方差分析表

图4 豆浆与乙醇配比对提取皂甙含量的影响

2.6 豆浆中皂甙提取条件的优化

通过单因素实验分析，选取反应温度、反应时间、豆浆与乙醇配比及水饱和正丁醇用量进行L16(45)正交实验［7］，实验方案及结果见表2。

极差分析结果表明(见表2)，影响提取液中皂甙含量的主次因素顺序为B＞C＞D＞A，即反应时间＞豆浆与乙醇配比＞水饱和正丁醇用量＞反应温度。不考虑交互作用，提取豆浆中皂甙含量的较优工艺条件为B2C3D3A2，即反应时间为3h，豆浆与乙醇配比为1∶5，水饱和正丁醇为90mL，反应温度为75℃。由于因素A和因素D对提取豆浆中皂甙含量的影响很小，因此可确定14号实验即为实验较优组合。此条件下，每100mL豆浆中含有的皂甙量为83.994mg。

在极差分析的基础上，对实验进行了方差分析，结果见表3。

图5 水饱和正丁醇用量对提取皂甙含量的影响

3 结论

采用乙醇、正丁醇提取豆浆中皂甙，通过单因素及正交实验确定豆浆中皂甙最优提取工艺条件为:反应时间为3h，豆浆与乙醇配比为1∶5，水饱和正丁醇为90mL，反应温度为75℃。此条件下豆浆中皂甙提取量为每100mL豆浆中含有皂甙量为89.668mg。

采用比色法测定豆浆中皂甙，以5%香草醛－冰乙酸溶液为显色剂，显色时间为15min、显色温度为70℃。在 558nm下测定，所得回归方程为 y=0.0013x－0.0073，R2=0.9987，线性可靠，曲线高度显著。此方法简便快捷，适于实验室使用。

［1］李建华，王绍.大豆皂甙的中枢心血管作用［J］.中国应用生理学杂志，1993，9(1):80－81.

［2］S.Kimura.The revelation of toxicity which is caused by some poisonous substances derived from foodstuffs and its modification under nutritional conditions［J］.Yakugaku Zasshi，1984，104(5):423－439.

［3］王章存 .大豆皂甙研究进展［J］.大豆科学，1996，15(1):7478.

［4］胡学烟，王兴国.大豆皂甙的研究进展(Ⅰ)——皂甙的分布、结构及其性质［J］.中国油脂，2001，26(4):29－33.

［5］许金新，陆安国.大豆皂甙的生理功能及应用［J］.中国饲料博览，2003(10):11－13.

［6］魏静，张春红，刘长江.比色法测定大豆总皂甙的研究［J］.粮油加工，2006(10):60－62.

［7］王钦德，杨坚.食品实验设计与统计分析［M］.北京:中国农业大学出版社，2007:503.

［8］S Gohtani，Y Yamano.Stability and zeta potentialof soyasaponin I emμLsion［J］.Nippon Nogei Kagaku Kssihi，1990，64:139－144.

Extraction and determination of the saponins in soybean milk

QIAO Zhao－yang，CAO Hui*，XU Fei
(Institute of Medical Equipment and Food，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

TS214.2

B

1002－0306(2010)08－0258－04

2009－08－28 *通讯联系人

乔兆扬(1986－)，男，在读硕士，研究方向:食品质量与安全。