痛风灵散中非法添加吲哚美辛和醋酸泼尼松的检测研究

陈银华，徐凡，李海霞 (十堰市食品药品监督检验所, 湖北 十堰 442000)

李志浩 (湖北医药学院附属东风医院, 湖北 十堰 442000)

中成药、保健品非法添加化学药品现象在我国屡见不鲜，多年来，药品监督管理部门从未停止过对非法添加的专项整治和打击，但面对巨大的市场诱惑，不法商人仍然愿意铤而走险，打着中药治病，纯天然保健的旗号，偷偷在中成药和保健品中加入西药成分。非法添加化学药品的中成药和保健品多用于治疗慢性病和一些疑难病症，短期内可以起到明显的疗效，但是给人民群众的用药安全带来巨大风险。譬如在治疗难以治愈的痛风病等中药制剂中非法添加激素类、镇痛抗炎类等化学药品，长期服用会给患者带来不良后果[1]。

吲哚美辛和醋酸泼尼松为临床上较为常见的非甾体抗炎药和糖皮质激素，其消炎、退热、镇痛效果显著，且价廉见效快。因此常被不法商人添加进用于治疗痛风病等慢性疾病的中成药和保健品中，但其副作用极大。为了有效打击制假行为，笔者采用旨在建立HPLC-二极管阵列法(DAD)，以检测出其中非法添加的吲哚美辛和醋酸泼尼松。现报道如下。

1 仪器和试药

Dianox U-3000高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器(美国戴安公司)；XS105十万分之一电子天平(德国METTLER TLLEDO)；元素型1840A超纯水器(重庆摩尔)；吲哚美辛对照品(批号100258，含量100%)、双氯芬酸钠对照品(批号:100334-200302，含量:100% )、布洛芬对照品(批号100179-200804，含量100.0%)、醋酸泼尼松对照品(批号10012-0105)、醋酸地塞米松对照品(批号100122-201206)、地塞米松对照品(批号100129-201105)、氢化可的松对照品(批号100152-200206)均由中国食品生物制品研究院提供，供含量测定用；痛风灵散1批(市民送样，称购自私人诊所)；乙腈为色谱纯(美国天地)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

精密称取上述对照品适量，加甲醇分别制成浓度为0.2mg/mL的溶液作为对照品溶液。取样品痛风灵散内容物，混合均匀，精密称取约相当于一包的量，置100mL量瓶中，加甲醇80mL，超声提取30min，放冷，用甲醇稀释至刻度，过滤，滤液作为供试品溶液。

2.2 薄层色谱初筛

取供试品溶液和各对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-冰乙酸(10∶10∶0.2)为展开剂，预饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与吲哚美辛和醋酸泼尼松对照品色谱相应的位置上，检出了相应的荧光淬灭斑点。见图1。

图1 供试品和各对照品溶液色谱图

2.3 高效液相色谱条件

色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以庚烷磺酸钠(庚烷磺酸钠15.2mg，加三乙胺0.8mL，加水至1000mL，用冰乙酸调pH值至3.3)-甲醇-乙腈(25∶30∶0.18)为流动相，检测波长为254nm(全波长扫描)，柱温30℃，流速1ml/min，进样10uL。

2.4 线性关系考察

由于薄层色谱初筛及液相色谱只检出了吲哚美辛和醋酸泼尼松两个成分，因此含量测定的方法只考虑这两个成分。精密量取吲哚美辛对照品溶液1、2、4、6、8、10mL置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度；精密量取醋酸泼尼松对照品溶液1、2、4、6、8、10mL置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按上述方法测定，以峰面积(A)对进样浓度(C)作标准曲线，分别计算吲哚美辛和醋酸泼尼松的回归方程。吲哚美辛：A=246.9920C-6.6451,r=0.9995。吲哚美辛在0.069～0.691mg/mL范围内具有良好的线性。醋酸泼尼松：A=157.5508C-0.2081，r=0.9997。醋酸泼尼松在0.035～0.352mg/mL范围内具有良好的线性。

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，在2.3项的色谱条件下连续进样6次，计算吲哚美辛和醋酸泼尼松的RSD，分别为0.25%和0.30%(n=6)

图2 供试品与醋酸泼尼松和吲哚美辛对照品溶液的全波长匹配

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，在2.3项色谱条件下，每2h测定一次，连续测定7次，结果表明供试品溶液在12h内稳定，样品中吲哚美辛和醋酸泼尼松的RSD分别为0.44%和0.67%(n=7)。

2.7 加样回收试验

取已知含量的样品(相当于0.5包痛风灵散)，精密称取3份，分别加入吲哚美辛对照品16.8、21.0、25.2mg和醋酸泼尼松6.4、8.0、9.6mg，按2.1项下的方法制备供试品溶液，以2.3项下的色谱条件测定，计算回收率。吲哚美辛的平均回收率为99.0%，RSD为1.68%(n=3)；醋酸泼尼松的平均回收率为98.3%，RSD为1.81%(n=3)。

2.8 样品的检验结果

用2.2和2.3项色谱条件对该散剂进行检验，该样品薄层色谱图中只有两个荧光淬灭斑点，其Rf值与吲哚美辛和醋酸泼尼松对照品一致；液相色谱图中也只显示两个峰，它们的HPLC保留时间与吲哚美辛和醋酸泼尼松对照品一致，经过全波长光谱的匹配度检验，与吲哚美辛和醋酸泼尼松对照品的库相似度分别为999.81和999.89。见图2。基本可以确定为吲哚美辛和醋酸泼尼松。经含量测定，结果每包痛风灵散中含有吲哚美辛42.1mg，醋酸泼尼松16.7mg。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

参考相关文献[2～4]，曾试用不同比例的甲醇-水,甲醇-磷酸-水，乙睛-冰醋酸-水，乙睛-水等流动相系统进行等度和梯度洗脱分离。经过试验，上述流动相系统在测定五种化学物质时，有的分离度较差，有的理论板数过低。最终采用了庚烷磺酸钠(庚烷磺酸钠15.2mg，加三乙胺0.8mL，加水至1000mL，用冰乙酸调pH值至3.3)-甲醇-乙腈(25∶30∶0.18)为流动相，结果显示本法操作简便，供试品溶液中组分分离度良好，塔板数较高。

3.2 含量测定检测波长的选择

从两种物质全波长扫描图可以看出，吲哚美辛的最大吸收在257nm，醋酸泼尼松的最大吸收在242nm，均在254nm附近有比较大的吸收值，故选择254 nm作为检测波长。

3.3 提取溶剂和提取时间的选择

取适量样品7份，分别加甲醇、60%甲醇、20%甲醇、无水乙醇、60%乙醇、20%乙醇、水20mL，超声提取30min，过滤，测定，结果用甲醇处理效果最佳。取样品，加甲醇，分别超声处理10、20、30、40、50、60min后，测定，计算，结果在30min内提取完全。故选择溶剂甲醇、超声30min。

3.4 检验结果分析

经检验，该散剂薄层色谱只有两个荧光淬灭斑点，HPLC基线平整，且只有两个色谱峰，初步判断该散剂中可能不含中药成分，仅含两种化学药，其薄层Rf值及液相保留时间与吲哚美辛和醋酸泼尼松对照品一致。对两个峰进行二极管阵列紫外光谱检测，与吲哚美辛和醋酸泼尼松对照品匹配。因此可以基本判断出该假药非法添加了这吲哚美辛和醋酸泼尼松。下一步将采用HPLC-MASS进行进一步验证。

该批样品为群众投诉样品。该样品标注名称为“痛风灵散”，为一个体医生中药祖传秘方，处方不公开，无生产厂家。每日服用两次，每次1包，患者服用后疗效显著，痛风症状立即减轻，服用两天后关节红肿疼痛基本消失，但头痛、恶心等反应较严重，怀疑是药物的副作用大，遂送检。经检验，每包中含有吲哚美辛42.1mg，醋酸泼尼松16.7mg，属非法添加，且剂量过大，长期服用此类假药会造成药源性疾病，造成严重的毒副作用。

本方法灵敏度高、专属性强、操作简便快捷、环保安全、成本低廉，适用于基层单位的快速筛查吲哚美辛和醋酸泼尼松的非法添加，有效提高监督检验的效率和靶向性，打击违法行为。

[参考文献]

[1]赵晓娟.激素类药物的不良反应[J].辽宁医学杂志，2001,15(6):294～296.

[2]张少敏,陈斌,凌善文,等.非法添加抗痛风类化学药检测方法的研究[J],药学服务与研究，2012,12(3):199～201.

[3]徐军辉,李存金,王仕平,等.中成药中非法添加化学药品吲哚美辛检测方法的研究[J].中国药品标准,2010,11(6):416～420.

[4]郭宏,张月辉.HPLC法同时测定抗风湿类中成药中的5种糖皮质激素[J].辽宁中医杂志,2015,42(9):1721～1723.