Meta分析评估肌萎缩侧索硬化患者磷酸化神经丝蛋白的临床诊断价值

杨彦 (湖北中医药高等专科学校护理系，湖北 荆州 434020)

胡小辉 (长江大学第二临床医学院 荆州市中心医院神经内科，湖北 荆州 434020)

刘玲华 (湖北中医药高等专科学校护理系，湖北 荆州 434020)

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种运动神经元疾病，患者中位生存时间为2～4年，但是诊断延迟时间可长达8.6～16.8月[1]。诊断延迟的原因与发生率极低和临床表型变异大有关[2]，而各种各样的ALS模拟综合征，如多灶性运动神经病、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩和脊髓小脑共济失调3型等，使ALS诊断更复杂化[3]。因此，需要寻找ALS的诊断生物标记物，以便提高其诊断准确性。

对于ALS患者，运动神经元轴突的快速退变可能会导致pNfH显著升高[4]。近年来，有关ALS患者脑脊液(CSF)磷酸化神经丝蛋白重链(pNfH)变化的研究逐渐增多，Xu Z等采用Meta分析的方法证明了ALS患者CSF和血液中神经丝蛋白轻链(NFL)水平较健康者和非ALS疾病者明显升高[5]，但是尚未有报道采用Meta分析的方法评估ALS患者CSF pNfH临床运用价值。因此，我们采用Meta分析的方法估计了CSF pNfH 在诊断ALS中的作用。

1 资料与方法

1.1 搜索策略

根据Cochrane手册[6]，系统检索已发表在“PubMed”、“Springer”和“Medline”数据库，以及列在文章的参考文献，时间限定为至2017年1月，语言限制为“英语”，关键字为“Neurofilament”, “Neurofilament light chain”, “Neurofilament heavy chain” 和 “Amyotrophic lateral sclerosis”。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：①诊断为ALS的患者。②回顾性或前瞻性病例对照研究设计。③对CSF pNfH水平进行检测。除此之外，排除标准包括：①非人类的研究、评论、评论、会议、社论和手稿。②病例报告和病例系列，无健康或非ALS疾病组对照。③研究对象为儿童、青少年和孕妇。④不能从原始文献中提取CSF pNfH平均值和标准差。

1.3 数据提取与质量评价

两名研究人员评估搜索结果和选定的文章，提取研究数据。对纳入报道的方法学质量评估采用纽卡斯尔-渥太华评分(NOS)标准[7]，包括选择性(0～4分)，可比性(0～2分)，和暴露(0～3分)类，低于6分的报道标为低质量。

1.4 统计学分析

采用Chi-squared (I2) 进行异质性分析。为计算平均标准均差(Std.md)和95%可信区间(CI)，当异质性检验P≥0.05时采用固定效应模型，当异质性检验P<0.05时采用随机效应模型。敏感性分析采用亚组分析。漏斗图评估发表偏倚。绘制HSROC评价CSF pNfH 在诊断ALS中的敏感性和特异性。异质性、合并Std.md、漏斗图和HSROC模型采用RevMan5.3版(Copenhagen: The Nordic Cochrane Centre, The Cochrane Collaboration, 2014)。并且，采用Meta回归分析各研究间的异质性来源。Meta回归采用Comprehensive Meta-Analysis 2软件 (Biostat, Englewood, NJ)进行计算。

2 结果

2.1 文献检索结果及纳入研究的一般特点

根据纳入标准，删除重复的报告后，总共检索到174篇文献。根据排除标准，提取了7例病例对照研究资料[8～14]。在汇总CSF pNfH在诊断ALS过程中的敏感性和特异性时，提取了7篇病例对照研究[8, 9, 11～13, 15, 16]。

纳入本次Meta分析的报道基本特征列于表1。7篇报道[8～14]共汇集了26组数据，有792例参与者，包括500名ALS患者和280例健康或非ALS疾病对照者。ALS患者症状出现的平均年龄为64.5岁。此外，ALS患者平均病程为9.6月(7～85.3个月)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术，如夹心ELISA、SMI35 pNfHAb(Sternberger)和pNfH ELISA Kit(biovendor)，检测CSF pNfH水平。根据NOS标准[7]，纳入的研究方法学评分均大于6分。

此外，CSF pNfH在ALS的诊断过程中的敏感性和特异性数据分别从7项报道[8, 9, 11～13, 15, 16]中提取数据(表2)，并用于绘制HSROC模型。7篇报道中共包括884例参与者，其中有477例ALS患者和407例健康和非ALS疾病对照者。

2.2 ALS患者脑脊液 pNfH水平

在比较ALS 患者CSF pNfH水平与健康和非ALS疾病对照组的差异时汇总了7篇报道，含25个亚组，亚组之间存在明显的异质性(I2= 88%，P<0.00001)。因此，采用随机效应模型计算合并Std.MD(图1)。ALS患者pNfH水平高于健康和非ALS疾病对照组(Pooled Std.MD=1.78，95%可信区间：[1.16，2.40]，P<0.00001)。

2.3 ALS患者脑脊液NFL水平

当比较ALS患者与健康和非ALS疾病对照者CSF NFL水平时，共纳入3篇报道共15亚组，亚组之间存在明显的异质性(I2=81%，P<0.00001)。采用随机效应模型计算合并Std.MD。ALS患者CSF NFL水平均高于健康和非ALS疾病对照组(Pooled Std.MD=1.84，95%可信区间：[ 1.10，2.58 ]，P<0.00001)。

2.4 敏感性分析

根据人口变异、检测技术、ALS组和对照组样本量等进行亚组分析。研究人群来源于中国的报道之间存在低异质性(I2=55%，P=0.14)。采用了夹心ELISA或SMI35 pNfH抗体检测技术的报道之间存在低异质性(I2=38%，P=0.21)。此外，ALS患者样本量为6至30(I2=0%，P=0.78)，0至5(I2= 35%，P=0.06)，31至60(I2= 53%，P=0.14)的报道之间存在无或低异质性。并且，包含非ALS疾病对照者的报道之间存在低异质性(I2= 32%，P=0.12)。最后，采用固定效应模型显示表明ALS患者CSF pNfH水平高于正常健康和非ALS疾病对照组(Pooled Std.MD=1.83，95%可信区间：[ 1.64，2.01 ]，P<0.00001)。

图1 森林图显示肌萎缩侧索硬化患者脑脊液磷酸化神经丝重链较对照组明显升高CSF脑脊液

图2 层次综合受试者工作特征曲线 (HSROC) 模型评价采用pNfH ELISA kit(Biovendor)、Sandwich ELISA 和 SMI35 pNfH Ab (Sternberger)检测的磷酸化神经丝重链在鉴别肌萎缩侧索硬化 和健康者及非肌萎缩侧索硬化疾病中的敏感性和特异性

2.5 发表偏倚

在25组数据中，采用漏斗图视觉评估发表偏倚。漏斗图中存在不对称分布，在本Meta分析中存在较高的发表偏倚风险。

2.6 Meta回归分析影响ALS患者和对照组之间的脑脊液pNfH差异的因素

年龄、ALS患者和对照组样本量、ALS病程、ALS患者组和对照组之间的CSF NFL水平Std.MD被汇集到Meta回归模型中。 ALS患者和对照组之间CSF pNfH Hedges’s g与CSF NFL水平变化一致(r=0.784，P=0.003)，和ALS患者(r=0.012，P=0.00033)和对照组(r=0.029，P=0.003)样本量明显相关。此外，CSF pNfH Hedges’s g与ALS患者平均年龄(r=0.055，P=0.140)、对照组平均年龄(r=0.030，P=0.355)及ALS患者病程(r=0.019，P=0.157)无关。

2.7 HSROC模型评价CSF pNfH在诊断ALS中的敏感性和特异性

从7篇报道[8, 9, 11～13, 15, 16]中提取了CSF pNfH在诊断ALS中的敏感性和特异性数据，绘制HSROC(图2)。视觉评估HSROC显示CSF pNfH在从健康或非ALS疾病对照组中鉴别出ALS患者存在一定的敏感性和特异性。此外，如HSROC所示，用pNfH ELISA试剂盒(Biovendor)的检测方法在从健康或非ALS疾病对照组中鉴别出ALS的敏感性和特异性高于 Sandwich ELISA 或 SMI35 pNfH Ab (Sternberger)检测技术。

3 讨论

本次Meta分析表明ALS患者CSF pNfH水平高于健康及非ALS疾病对照组。虽然纳入的报道间存在明显的异质性，但是亚组分析和Meta回归发现了异质性的主要来源。此外，通过Meta回归首次揭示CSF pNfH与轴索损伤的标记物NFL显著相关。

亚组分析探讨了人口变异、检测技术、ALS组样本量对ALS患者CSF pNfH相对于健康及非ALS疾病组水平升高的影响。首先，来源于欧洲的23组数据间存在明显的异质性，而2组来源于中国的数据间具同质性。因此，人口变异是异质性来源之一。其次，采用夹心ELISA或SMI35 pNfHAb检测技术探测CSF pNfH水平的研究间具同质性。此外，采用pNfH ELISA Kit技术探测CSF pNfH水平的研究间存在显著的异质性。因此，CSF pNfH检测技术可能是异质性来源之一。最后，ALS组样本量为0～5，6～30，31～60的研究间分别存在无或低异质性，因此ALS组样本量的大小是异质性的一个来源。此外，由于ALS患者CSF pNfH变化与ALS和对照组样本量呈明显正相关，因此健康及非ALS疾病对照组的样本量大小也被认为是异质性的来源之一。本研究首次报道了人口变异、检测方法、样本量是ALS患者CSF pNfH水平与健康或非ALS疾病对照组间差异的主要异质性来源。

pNfH被认为神经系统损伤的生物标志物[4]。Meta回归分析显示，在ALS患者CSF中，pNfH的变化趋势和NFL水平变化一致。轴突中NF蛋白的积累有助于维持神经元损伤后轴突细胞骨架的稳定，同时，NF 碳末端磷酸化在轴突生长中起重要作用[4]。NFL作为NF一个亚基，随着时间的推移，CSF NFL水平升高与ALS患者疾病泛化和皮质脊髓束变性严重程度相关[17]。因此，pNfH作为NF的活性形式，是在神经系统损伤后评估ALS患者的大脑和脊髓轴突损伤病理变化的较为有价值的生物标记物[14]。

虽然Oeckl等的研究发现pNfH与ALS的病程之间存在显著的负相关[12]，但是Meta回归显示ALS病程与ALS患者CSF pNfH水平变化无相关性。原因可能与Oeckl PP等的多中心临床研究中ALS病程变异范围较Meta回归中汇总的ALS患者病程有关：Oeckl PP等的研究中ALS病程为4月至247.4月[12]，而纳入本次Meta分析的ALS患者平均病程为7月至85.3月(表1)。在Ganesalingam J等的研究中，CSF pNfH与ALS病程呈负相关[16]，然而，大多数ALS患者病程少于50月，只能反映CSF pNfH与ALS早期病程的关系。此外，在Ganesalingam J等的研究中[16]，CSF pNfH主要在ALS疾病早期增加，在ALS疾病后期升高并不明显[12, 16]。因此，仍然需要更多样本的前瞻性研究评估CSF pNfH与ALS病程的关系。

HSROC显示CSF pNfH在鉴别ALS和非ALS疾病时具有较高的敏感性和特异性(图2)，并且，采用pNfH ELISA试剂盒(biovendor)区分ALS和非ALS的敏感性和特异性比采用夹心ELISA或SMI35 pNfHAb检测方法更高。因此，在区分ALS和非ALS疾病时，建议采用pNfH ELISA试剂盒检测pNfH CSF水平。

当前Meta分析存在一定的局限性。第一，原始研究多为观察性或横断面研究。选择性偏倚不可避免。第二，虽然人口变异、检测技术，样本量是纳入文献的主要异质性来源，但是纳入文献的高度异质性削弱了ALS患者CSF pNfH水平高于非ALS疾病患者的说服力。第三，在汇总分析CSF pNfH水平在ALS患者和健康及非ALS疾病组中的变化时，研究文献间存在明显的发表偏倚。发表偏倚可能来源于未发表的阴性结果。第四，不同的中心或实验室提供的研究样本量太少(5例)[10,14]。第五，某些研究中ALS患者和对照组之间平均年龄存在显著差异，并且对照组的疾病谱多样化，严重影响了ALS和对照组的可比性(表1)。第六，ALS的诊断主要依赖于临床表现和肌电图结果，采用腰椎穿刺抽取ALS患者脑脊液临床少见，因此，在评估ALS患者病情过程中，检测血液pNfH可能会比CSF更实用[11]。

表1 纳入文献的基本特征

注：Con.: 对照组, Se.: 选择, Co. : 可比性, Ex.: 暴露, ALS: 肌萎缩侧索硬化患者, MND: 运动神经元病, MSA: 多系统萎缩, NR: 未涉及, ALS mimic syndrome ALS 模拟综合征。

表2 采用脑脊液磷酸化神经丝重链蛋白水平鉴别肌萎缩侧索硬化症(ALS)

注：. 截止值(Cut-off)单位: ng/mL。

总之，ALS患者CSF中pNfH和NFL水平均高于健康或非ALS疾病对照组。人口变异，pNfH检测技术，样本量和ALS患者CSF NFL水平是纳入研究间的主要异质性来源。如Meta回归所示，在ALS患者CSF中，pNfH与NFL相关的轴索损伤和神经退变有关。HSROC模型显示在鉴别ALS和健康及非ALS疾病中，CSF pNfH水平变化有一定的临床鉴别价值。

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