白三叶TrFQR1基因克隆与表达分析

吴 星，张 艳，雍 斌，李 州，彭 燕

(四川农业大学 动物科技学院，成都 611130)

TrFQR1属于依赖FMN的还原酶超家族，是一个以FMN为辅基且依赖于NADPH的醌氧化还原酶家族蛋白[FMN-dependent NADPH quinone reductase family (FMN_red)][1]。FMN(flavin mononucleotide)是黄素蛋白的辅基，参与氧化还原反应、催化脱氢、氧化和电子转移或羟基化过程，在呼吸等生物氧化过程的电子传递中具有重要作用[2]。醌作为一种自然界中广泛存在的有毒物质，能诱发哺乳动物细胞癌变和坏死[3]。醌氧化还原酶能减少醌类转化可能引起的细胞器及遗传物质损伤，保证机体的正常生理功能，因而受到广泛关注[4]。已有证据表明，该类基因及其产物与多种疾病的发生关系密切，具有对醌类物质的解毒作用[5-7]。李莉等[8]的研究发现，NQO1的表达水平与卵巢癌预后并无明显相关性，而NQO2表达水平越高，卵巢癌临床预后越好；王艳等[9]的研究发现，细胞内NQO1表达量增高能减少多巴胺引起的细胞内醌化蛋白含量，从而减轻多巴胺对细胞产生的毒性作用；陈浩等[10]的研究发现，激活Nrf2/NQO1通路可以调节胃黏膜组织中SOD和 MDA的活性，增强细胞对氧化应激的耐受性，发挥保护细胞的作用；张大生[11]的研究发现，NQO1参与了血根碱的还原反应，NQO1过表达降低了血根碱诱导的细胞毒性，起保护细胞的作用；还有许多研究表明，大肠杆菌中 WrbA 受胁迫响应 SIGMA 因子RpoS 控制，在受到酸、盐和过氧化氢等胁迫下表达量增加[12-16]。

白三叶(Trifoliumrepens)是一种世界性分布与栽培的多年生豆科饲草，由于具有蛋白质含量高、再生速度快以及良好的固氮能力等特点，在改良天然草地和建植人工混播草地过程中发挥着巨大作用[17-18]。然而，白三叶属浅根型作物，喜冷凉湿润气候，抗旱耐盐性等[19-20]抗逆性较差。干旱、盐碱等非生物胁迫常导致白三叶细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量增加，引起膜系统氧化损伤，最终导致细胞死亡[21-24]。在白三叶抗逆机制的研究中，清除ROS、MDA等物质能够显著提高白三叶的抗逆性[18]。

综上所述，醌氧化还原酶的研究大多集中于与细菌和人类相关的研究中，并且常作为一种还原剂，参与氧化还原反应，保护细胞免受毒害。而在白三叶中，TrFQR1是否能减轻细胞氧化伤害，响应非生物胁迫，提高抗逆性，仍未见报道。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理

以‘拉丁诺’白三叶为供试材料，采用石英砂基质培养。选取籽粒饱满、大小一致的白三叶种子，经0.1% NaClO消毒后，均匀播种在装有石英砂的白色育苗盘(长35 cm，宽25 cm，高10 cm)，24 ℃光照培养箱中(光强2 000 lx)进行发芽，待发芽7 d后，用Hoagland全营养液继续培养，温度为白天23 ℃，夜晚19 ℃，时长均为12 h，相对湿度为75%，光强250 μmol·m-2·s-1，每2 d更换1次营养液，全营养液培养30 d后用于试验。分别用15% PEG6000、200 mmol/L NaCl、4 ℃低温、600 μmol/L CdSO4、25 μmol/L SNP、0.02 mmol/L NaHS、10 mmol/L H2O2和5 mmol/L CaCl2溶液，对30 d的白三叶幼苗全株进行处理，处理时间为0、1.5、3、6、12和24 h。每处理每个时间点处理15株，处理完相应时间后，随机分成3份，每份5株进行取样编号(取成熟的第2叶)。取样后立即用液氮冷冻，提取各处理的总RNA用于cDNA的合成，其中15% PEG处理3 h的样品也用于制备5/3-RACE-ready cDNA，RNA保存在-80 ℃冰箱。

PCR反应体系中的高保真酶用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(宝生物公司提供)，白三叶RNA提取参照捷倍斯公司试剂盒(Plant RNA Kit)说明书，5/3-RACE-ready cDNA 用宝生物公司试剂盒合成(SMARTerTM)，提取的总RNA参照美国Bio-Rad Laboratories公司反转录试剂盒(iScriptTMcDNA Synthesis Kit)说明书进行反转录获得cDNA第一链。内参引物为实验室筛选的肌动蛋白基因(β-Actin)特异引物。实时荧光定量PCR参照宝生物公司试剂盒(SYBR Premix Ex Taq II)说明书，所用仪器为ABI的7500fast设备。

1.2 方 法

1.2.1白三叶TrFQR1基因克隆用已测转录组中FQR1的mRNA序列去NCBI数据库上比对同源基因的阅读框，在靠近起始密码子和终止密码子且同源性高的区域设计跑5′-RACE(5′-CAGCCTCAGCGAGTTCATCTGGGGT-3′) 和3′-RACE的引物(5′-AAGGCGGTGGACAAGAGACTACAGCG-3′)，再用已制备的5′/3′-RACE-ready cDNA为模板，分别进行扩增。PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5个循环。扩增产物进行电泳检测(1%)；参照天根生物普通琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒说明书对目的片段进行回收；采用pMD-19T载体连接回收产物；连接成功后转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞并培养10～12 h。然后进行蓝白斑检测筛选，挑选白斑进行菌液培养，然后经PCR检测选取5个阳性菌落送华大基因(北京)股份有限公司进行测序。

根据上述试验获得的序列设计阅读框的引物，即ORF-F(5′-ATGGCTGTCAAACTTTACATTGTAT-3′)和 ORF-R(5′-ATTATGCAGCTTCCTTGAGCTTCTT-3′)，再用15% PEG处理3 h的‘拉丁诺’白三叶叶片cDNA为模板进行扩增。RT-PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 5 s，35个循环；72 ℃ 10 min。得到的扩增产物进行电泳检测，切胶回收，连接载体，转化大肠杆菌，涂板筛选，挑菌检测，测序,具体步骤同上。

将2次测序得到的序列去掉载体序列，再用DNAMAN 软件进行拼接，获得白三叶TrFQR1 cDNA全长。

1.2.2TrFQR1生物信息学分析利用DNAMAN 软件找到TrFQR的 ORF，并进行蛋白翻译预览，找出其编码的氨基酸序列。用Protparam工具进行蛋白质基本理化性质分析。氨基酸疏水性分析采用Protscale。跨膜结构预测采用TMHMM软件。利用SignalP4.1 Server预测蛋白信号肽。利用SOPMA工具预测蛋白质二级结构。利用Swiss-Model软件进行蛋白质三级结构分析。采用NetPhos 3.1 Server预测磷酸化位点。用FoldIndex 进行无序化特征预测。

利用Blast程序软件，从GenBank中再挑选8个来源于豆科(蝶形花科)植物的依赖FMN的还原酶超家族基因编码的蛋白质氨基酸序列，利用ClustalX 2软件进行氨基酸多序列比对分析，并用Mega5.1 软件基于邻位相连法构建系统发育树。

1.2.3白三叶TrFQR1的表达模式依据引物设计原则设计‘拉丁诺’白三叶TrFQR1定量表达引物qPCR-F (5′-CTCCTTCCATACTGGTCTCCTCCGC-3′) 和qPCR-R (5′-GCCCAAACATTAGGTGGTCTT-3′)。以不同处理及不同处理时间的‘拉丁诺’白三叶叶片cDNA为模板，以β-actin (Act-F：5′-TTACAATGAATTGCGTGTTG-3′和Act-R：5′-AGAGGACAGCCTGAATGG-3′)作为内参，分别对其进行实时荧光定量。实时荧光定量PCR参考SYBR®Premix Ex TaqTMI (TliRNase H Plus)试剂盒说明书(大连TaKaRa公司), 采用两步法。扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。用96孔上样板，目的基因与内参基因对应，操作时避免强光照射。设3次重复。采用2-ΔΔCt方法[25]计算相对表达量。采用Excel2003进行绘图与数据处理；SAS8.0软件进行方差分析和显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 白三叶TrFQR1基因克隆

用 DNAMAN6.0软件分析试验得到的白三叶TrFQR1 cDNA，其长为1 003 bp。设计引物ORF-F、ORF-R克隆白三叶TrFQR1的编码区，纯化回收目的片段，连接pMD-19T载体后转化大肠杆菌, 利用菌液PCR筛选阳性克隆, 得到1条612 bp的目的片段(图1)，说明克隆TrFQR1基因已插入载体中。对挑选的阳性克隆进行测序得到碱基序列，测序结果(图 2)与预测结果一致。

2.2 TrFQR1结构和理化特性预测

通过DNAMAN6.0软件对TrFQR1进行翻译，发现其编码203个氨基酸。通过ProParam工具预测该蛋白分子式为C993H1529N251O290S8，分子量(MW)为21.88 kD，等电点理论为5.96，带有负电残基( Asp + Glu) 21个，带有正电氨基酸残基(Arg +Lys) 18个，肽链中Gly含量最多，共26个，占总量的12.8%； 其次是Ala，共23个，占11.3%。不稳定指数为32.77，低于40的阈值，预测此蛋白较稳定。总平均疏水指数(grand average of hydropathicity, GRAVY)为-0.116，表明该蛋白为亲水性蛋白(图3，A)。用Signal P4程序预测TrFQR1不含信号肽，因此不属于分泌蛋白(图3，B)。用TMHMM软件预测TrFQR1无跨膜结构(图3，C)。TrFQR1蛋白进行固有无序化分析的结果显示，TrFQR1蛋白没有无序化特征，预测该蛋白有较强的刚性结构，行使功能时其构象不会发生改变(图3，D)。磷酸化位点预测发现TrFQR1的11、29、53、58、118、162、178位氨基酸为丝氨酸(Ser) 磷酸化位点，13、114位为络氨酸(Tyr) 磷酸化位点，43、64、102、116、126、168、194、196位为苏氨酸(Thr) 磷酸化位点(图3，E)。用ExPASy-PROSITE预测发现TrFQR1具有Flavodoxin-like结构域，在 N 端 11～15 位氨基酸和 C 端112～165位氨基酸是 FMN 结合区域(图2)。用 SOPMA 工具分析氨基酸序列二级结构(图3，F) 表明，该蛋白中，α螺旋(α helix)有 100个氨基酸，占总量的 49.26%；无规则卷曲(random coil)有 54个氨基酸，占26.6%；延伸链(extended strand)和β转角(β turn)各29和20个，分别占14.29%和9.85%。三级结构预测结果如图 3，G。

M.DL2000；1. TrFQR1 编码区PCR产物图1 TrFQR1 编码区电泳产物M. DL2000; 1. PCR product of TrFQR1 coding sequenceFig.1 Electrophoresis results of TrFQR1 coding sequence

ATG. 起始密码子； TAA. 终止密码子；横线标出FMN 结合位点。图2 TrFQR cDNA 全长及其编码氨基酸序列ATG. Start codon； TAA. Start codon；Horizontal line. FMN binding siteFig.2 Nucleotide sequences and deduced sequence of amino acid residues of TrFQR

2.3 多重序列比对及系统进化发育树

将TrFQR1 cDNA 序列推导编码的氨基酸序列在NCBI 在线数据库进行 Blast，找到与TrFQR1一致性较高的同源蛋白有蒺藜苜蓿(XP_003596543.1)、鹰嘴豆(XP_004487638.1)和狭叶羽扇豆 (XP_019437051.1)等。 将白三叶TrFQR1氨基酸序列与其他 8个物种同源蛋白多序列比对，氨基酸序列相似度达到94.96%，而白三叶‘拉丁诺’TrFQR1与蒺藜苜蓿的相似度最高，为95.57%(图5) ，系统发育树结果也表明，白三叶‘拉丁诺’与蒺藜苜蓿遗传距离比较接近(图4)。

2.4 各处理下白三叶TrFQR1基因表达量的变化

由图6可看出，在PEG胁迫下，白三叶的TrFQR1基因的表达量在处理3 h时显著升高且达到最大值，为对照组的8.58倍；在NaCl处理下，白三叶TrFQR1基因的表达量持续升高；在低温处理中，白三叶TrFQR1基因的表达量在6 h时显著降低且达到最小值，为对照组的0.34倍；在CdSO4处理下，白三叶TrFQR1基因的表达量随着处理时间的增加而增加；在SNP处理中，白三叶TrFQR1基因的表达量在1.5 h时显著升高且达到最大值，为对照组的3.61倍；在NaHS处理中，白三叶TrFQR1基因的表达量在1.5 h时显著降低且达到最小值，为对照组的0.49倍；在H2O2处理中，白三叶TrFQR1基因的表达量在1.5 h显著升高，在6 h达到最大值，为对照组的8.43倍；在CaCl2处理中，白三叶TrFQR1基因的表达量在1.5 h时显著升高且达到最大值，为对照组的2倍。

A． 用ProtScale程序预测蛋白质疏水性; B. 用Signal P4程序预测信号肽; C. 用TMpred程序预测跨膜区段; D.FoldIndex预测蛋白无序化特征; E. NetPhos 3.1 Server预测磷酸化位点; F. 二级结构预测; G. 三级结构预测图3 白三叶‘拉丁诺’TrFQR1蛋白生物信息学分析A. Predicted protein hydrophobicity by ProtScale; B. Predicted signal peptide by Signal P4; C. Transmembrane helical segments predicted by TMpred; D. Predication of disordered proteins by FoldIndex; E. Predicted phosphorylation sites by NetPhos 3.1 Server; F. Predicted secondary structure; G. Predicted 3-D structureFig.3 Bioinformatic analysis of TrFQR1 protein in Trifolium repens cv. ‘Ladino’

图4 FQR1系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree of FQR1

图5 FQR1蛋白多序列比对Fig.5 Multiple protein sequence alignment result of FQR1

小写字母表示同一处理不同处理时间0.05水平差异显著图6 各处理下白三叶 ‘拉丁诺’ 叶片TrFQR1基因的相对表达量The normal letters mean significant difference amang the same treatments with different time at 0.05 levelFig.6 The relative expression levels of TrFQR1 gene in leaves of Trifolium repens cv. ‘Ladino’ with different treatments

3 讨 论

张通等[26]的研究表明，PwWrbA 蛋白由203个氨基酸组成，预测FMN结合位点在11～15和112～165氨基酸残基处。与本试验结果一致。从多系列比对及系统进化树上看，白三叶TrFQR1与蒺藜苜蓿、鹰嘴豆等植物也保持了高度相似性，说明TrFQR1进化的保守性。

查阅近20年来的相关文献可知，前人已研究了醌氧化还原酶对FMN的清除[27]，对泛素非依赖性蛋白酶体的降解[28]，对超氧化物的清除[29]，以及对白念珠菌(Candidaalbicans)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[30-32]的致病性。这些研究中，醌氧化还原酶作为一种抗氧化剂，在电子传递，氧化应激，抵御疾病等方面发挥了非常重要的作用。但关于醌氧化还原酶生物通路的研究却只有维生素K循环途径。由此可见，尽管Kishko等[33]已经研究了醌氧化还原酶与醌和 NAD(P)H的复合结构，但目前醌氧化还原酶的生物通路仍不全面，基因调控网络也不清晰，在植物中的功能研究更是少之又少。

本试验利用荧光定量PCR分析表明，TrFQR1的表达量在各非生物胁迫和信号刺激处理下，都有显著变化。TrFQR1的表达量在PEG处理3 h、NaCl处理1.5 h、低温处理6 h和CdSO4处理12 h时均有显著变化；而SNP、NaHS、H2O2和CaCl2信号刺激处理1.5 h时，TrFQR1的表达量就有显著变化。这说明TrFQR1对于信号刺激的响应更灵敏。在以上4种非生物胁迫中，TrFQR1的表达量在PEG处理3 h达到最大值，随后降低，在12 h又升高，出现双峰；低温处理6 h，TrFQR1的表达量达到最小值；TrFQR1的表达量随着NaCl处理时间延长而逐渐增加；而在CdSO4处理中，该基因的表达量在12 h才开始增加。因此TrFQR1的表达量对不同非生物胁迫的反应时间有差别，且响应方式不同。本试验结果表明，白三叶TrFQR1编码的醌氧化还原酶，能够在多种非生物胁迫下发挥作用，并且受信号分子调控。由此可知，醌氧化还原酶不仅参与维生素K循环，也可能参与到植物生命活动的其他调节途径中。但该基因在植物抗逆反应中的具体功能，参与的信号途径和调控机制等还需要进一步研究。

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