转CiCHS基因拟南芥的黄酮代谢及抗氧化能力分析

杨飞芸，刘 坤，崔 爽，王瑞刚,3，李国婧,3*

(1 内蒙古农业大学 生命科学学院，呼和浩特010018；2 内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，呼和浩特010018；3 内蒙古自治区植物逆境生理与分子生物学重点实验室，呼和浩特010018)

黄酮类化合物(flavonoids)是广泛存在于植物中的一类天然产物，在植物的生长、发育、开花、结果及耐盐、抗旱、防菌、防病等方面起着重要作用[1]，其生物活性多样，具有重要的药用价值[2]，一直以来都受到国内外学者的高度重视。黄酮类物质合成于苯丙烷次生代谢途径，合成前体是苯丙氨酸和丙二酰辅酶A，经PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、IFS等酶催化，经过羟基化、甲氧基化和烷基化过程形成不同的黄酮类物质[3]。同时这些酶能够在转录水平对黄酮类物质的生物合成进行调控[4-7]。

查尔酮合成酶(CHS)是植物黄酮代谢途径的第一个关键酶和限速酶，已有研究表明其对植物的花和种子等器官的着色及黄酮类物质的合成等会产生重要影响[8]。CHS不仅参与植物生长发育过程，同时在植物抵御紫外辐射、病原菌入侵等防御反应中也起着重要作用[9]。因此，CHS一直以来都是黄酮类化合物生物合成调控代谢工程领域的研究热点。

1983年，Kreuzaler等[10]通过UV诱导欧芹(Petroselinumhortense)悬浮培养细胞高表达出了CHS基因；Reimold等[11]首次克隆到了欧芹的CHS基因全长并分析了其表达的氨基酸序列。之后，科学家陆续从多种植物中克隆得到CHS基因并进行了功能分析。1993年，Li等[12]报道拟南芥(Arabidopsisthaliana)的CHS突变体对紫外辐射异常敏感。2009年，Li等[13]的研究阐明了CHS以香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物生成查尔酮的定量反应机制。Jigyasa等[14]证明内源性组织特异性短干扰RNA沉默了大豆(Glycinemax)种皮中的CHS基因家族从而导致其色素缺失而呈现黄色种皮。2015年，Chen等[15]发现在烟草(NicotianatabacumL.)中过表达紫茎泽兰(Eupatoriumadenophorum)EaCHS1基因可以使转基因植物的黄酮类物质含量增加。2017年，Chen等[16]克隆到了烟草的5个CHS基因并对其进行了功能分析。

中间锦鸡儿(Caraganaintermedia)是豆科锦鸡儿属植物，具有良好的饲用、防风固沙和药用功效[17]，抵御逆境能力强[18]，含有多种次生代谢产物，其中黄酮类化合物含量丰富。为了分析其抵抗生物和非生物胁迫能力的机制，本研究利用其他豆科植物已知的查尔酮合成酶基因(CHS)保守序列设计简并引物，扩增得到中间锦鸡儿查尔酮合成酶基因的保守片段，经RACE技术扩增得到基因全长[19]，并且构建了中间锦鸡儿CiCHS基因过表达载体并转化野生型拟南芥，对转基因拟南芥的相关指标进行了检测，研究CiCHS基因的功能，为其进一步利用提供理论依据，同时为提高作物对UV辐射等胁迫的抵抗力及耐受性提供有效的基因资源。

1 材料和方法

1.1 植物材料

中间锦鸡儿种子采自内蒙古自治区和林县。野生型拟南芥Columbia-0生态型(Col-0)由内蒙古自治区植物逆境生理与分子生物学重点实验室保存。拟南芥突变体tt4(SALK_020583C)由东北师范大学遗传与细胞研究所高翔老师惠赠。

1.2 方 法

1.2.1pCanG-CiCHS植物表达载体构建将CiCHS基因编码区进行扩增[19]，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生物公司)回收目的片段，插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中(北京全式金生物公司)，将测序验证后的序列通过SpeI和XbaI(Thermo公司)酶切后连入由CaMV35S驱动的植物表达载体pCanG-HA中，进行菌落PCR及双酶切验证，将验证正确的重组质粒电转化农杆菌GV3101感受态细胞，进行菌落PCR鉴定挑取阳性克隆。PCR引物合成及产物测序由上海生工生物公司完成。

1.2.2拟南芥遗传转化及纯合体筛选采用浸花法将重组表达载体pCanG-CiCHS转入野生型拟南芥[20]，并用25 mg/L卡那霉素筛选阳性植株。提取T3代转基因植株总RNA，反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR对CiCHS在转基因株系中的表达量进行检测。按照SYBR Premix ExTaq试剂盒(TaKaRa公司)说明书操作，利用Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪(Roche公司)进行扩增。反应体系为：SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL，稀释的cDNA模板5 μL，上、下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)，DEPC水3.4 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。所用引物为CiCHS-qF(5′-CGCAGACTATTCTCCCCGATTC-3′)和CiCHS-qR(5′-CCTCCACCAAACTCTTCTCAATGT-3′)，内参引物为At EF1α- F(5′-AGAAGGGTGCCAAATGATGAG-3′)和At EF1α-R(5′-GGAGGGAGAGAGAAAGTCACAGA-3′)，基因表达量以2-ΔCt法计算，选取3株表达水平较高的株系进行后续表型实验。

1.2.3转基因拟南芥AtCHS表达量的检测提取T3代转基因植株总RNA，反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR对拟南芥的AtCHS(At5g13930)在转基因株系中的表达量进行检测。检测方法同转基因纯合体CiCHS表达量的检测。所用引物为AtCHS-qF(5′-GGTGCCATAGACGGACATT-3′)和AtCHS-qR(5′-TCCATACTCGCTCAACACG-3′)，内参引物为At EF1α- F和At EF1α-R，基因表达量以2-ΔCt法计算。

1.2.4转基因拟南芥总黄酮含量检测采用硝酸铝比色法进行总黄酮的测定[21]。剪取正常生长条件下(22 ℃，16 h光照/8 h黑暗)4周大的拟南芥主薹，用液氮研磨成粉末。总黄酮的提取条件：70%甲醇为溶剂；料液比1∶20；超声条件温度60 ℃，功率160 W，70 min；超声处理后浸泡24 h。浸提液0.8 mL，加5% Na2NO2溶液0.08 mL，搅匀后静置6 min；加10% Al(NO3)3溶液0.08 mL，搅匀后静置6 min；加4% NaOH溶液0.8 mL、ddH2O 0.24 mL，搅匀后静置15 min。8 000 r/min离心10 min，取上清液，使用分光光度计于510 nm处测定吸光值，用70%甲醇调零。

1.2.5转基因拟南芥柚皮苷含量检测样品前处理同总黄酮检测的前处理方法。使用高效液相色谱法(HPLC)进行柚皮苷含量的检测(岛津LC-20AT高效液相色谱仪)。色谱条件为：色谱柱Unitary C18( 4.6×250 mm，5 μm)；流动相：水(A)-甲醇(B)(60∶40，V/V)；流速0.8 mL/min；检测波长282 nm；进样体积10 μL。柚皮苷标准样品购自贵州迪大试剂公司。

1.2.6转基因拟南芥丙二醛含量检测对正常条件下生长4周大的不同基因型拟南芥在距离310 Lux的紫外灯下25 cm处照射1 h后，放回温室中恢复24 h。剪取正常生长和处理后的拟南芥植株主薹，用液氮研磨成粉末。丙二醛(MDA)含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，检测方法按照试剂盒说明书进行。

1.2.7DPPH法检测转基因拟南芥体外抗氧化活性剪取正常条件下生长4周大的拟南芥植株主薹，用液氮研磨成粉末。按料液比1∶20加入95%乙醇∶0.1%盐酸(3∶2，V/V)的混合溶液。超声提取时间30 min，温度60 ℃，功率160 W。超声处理后浸提24 h，5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。DPPH(1,1-二苯基-2-硝基苦肼)检测步骤根据Thaiponga等[22]的方法进行改良。

分别吸取：①样品提取液和DPPH溶液(0.1 mmol/L)；②样品提取液和甲醇；③甲醇和DPPH溶液(0.1 mmol/L)各0.75 mL于2 mL Eppendorf管中，摇匀后在避光条件下反应90 min。实验中将甲醇设为空白对照，于波长517 nm处分别测定样品吸光度Ai(样品与DPPH溶液反应后测得的吸光值)、Aj(样品与甲醇反应后测得的吸光值)和A0(甲醇与DPPH溶液反应后测得的吸光值)。

根据下列公式计算拟南芥植株提取液对DPPH的清除率：

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.2.8拟南芥突变体tt4的互补实验采用浸花法将重组表达载体pCanG-CiCHS转入拟南芥tt4突变体，并将收取的种子种在含有25 mg/L卡那霉素的1/2 MS培养基上筛选阳性植株。提取T3代转基因植株总RNA，反转录成cDNA，利用特异性引物CiCHS-F和CiCHS-R对转基因植株进行PCR鉴定。同时对所收种子的种皮颜色进行比对。

2 结果与分析

2.1 pCanG-CiCHS植物表达载体构建及转基因纯合体植株鉴定

利用PCR扩增到长度为1 173 bp的CiCHS编码区(图1，A)，连接到pEASY-Blunt Simple克隆载体中，测序正确后用SpeI和XbaI双酶切连接到pCanG-HA表达载体。将构建好的重组表达载体pCanG-CiCHS转化大肠杆菌并进行菌落PCR验证(图1，B)，提取验证正确的菌落质粒用SpeI和XbaI双酶切鉴定，能够切出目的片段，表明载体构建成功(图1，C)，构建好的载体图谱见图1，D。

通过农杆菌介导的浸花法将重组植物表达载体pCanG-CiCHS转入野生型拟南芥，筛选出具有卡那霉素抗性的阳性纯合体株系6株，提取这些株系的RNA并合成cDNA，利用特异性引物CiCHS-F和CiCHS-R进行RT-PCR鉴定。结果如图2，A所示，以野生型拟南芥cDNA作阴性对照没有扩增出目的条带，以中间锦鸡儿cDNA作阳性对照扩增到和转基因株系相同的条带，在6个转基因株系中均扩增出目的条带，表明CiCHS在各转基因株系中均有表达。同时利用实时荧光定量PCR检测CiCHS在转基因株系中的表达水平(图2，B)，选取表达量较高的3个株系OE-14、OE-15和OE-20进行后续表型检测实验。

M. DL2000；A. CiCHS的ORF；B. pCanG-CiCHS的菌落PCR鉴定：1～10. 随机挑取的单菌落；C. pCanG-CiCHS的酶切验证：1. 空载体对照;2. pCanG-CiCHS被Spe Ⅰ和XbaⅠ双酶切鉴定；D. 表达载体图图1 pCanG-CiCHS表达载体的构建与鉴定M. DL2000; A. The ORF of CiCHS; B. Identification of pCanG-CiCHS by PCR: 1-10. Random single colony; C. Identification of pCanG-CiCHS digested by restriction enzyme: 1. Vector control; 2. Digestion product by Spe Ⅰ and XbaⅠ; D. Schematic representation of the expression vector pCanG-CiCHSFig.1 The construction and identification of pCanG-CiCHS recombinant vector

2.2 转基因拟南芥AtCHS表达量的变化

前人研究表明，异源CHS基因转化植物时可能引起内源CHS基因表达量降低或不表达。本研究提取CiCHS表达量较高的3个株系OE-14、OE-15和OE-20的RNA并合成cDNA，利用实时荧光定量PCR检测AtCHS在转基因株系中的表达水平(图3)。图3显示，3个转基因株系中AtCHS的表达量均降低到野生型的十分之一左右，说明CiCHS在拟南芥中的表达抑制了拟南芥自身AtCHS的表达。

2.3 转基因拟南芥总黄酮含量的变化

按照硝酸铝比色法的具体步骤绘制芦丁标准曲线(图4，A)。由标准曲线可知，芦丁质量浓度x和吸光值y的关系为：y= 12.244 4x-0.014 4，(R2= 0.998 8)，表明在芦丁浓度为0～0.07 mg/mL范围内该标准曲线线性良好。按此方法进行转基因拟南芥总黄酮含量的测定，利用测得的吸光值，根据标准曲线线性方程计算总黄酮的含量。结果(图4，B)表明转基因各株系总黄酮的含量均高于野生型，且达到极显著水平。结合2.2的结果可以得出，过表达CiCHS可以使得拟南芥中总黄酮含量明显增加。

A. CiCHS过表达株系的PCR鉴定：M. DL2000；Col-0. 阴性对照(野生型拟南芥cDNA)；Ci. 阳性对照(中间锦鸡儿cDNA)；OE-14、OE-15、OE-20、OE-23、OE-29和OE-31. CiCHS过表达株系；B. CiCHS过表达株系的qRT-PCR检测图2 CiCHS过表达株系鉴定及表达水平检测A. RT-PCR identification of CiCHS transgenic Arabidopsis lines：M. DL2000; Col-0. Negative control (wild type Arabidopsis thaliana cDNA); Ci. Positive control (Caragana intermedia cDNA); OE-14, OE-15, OE-20, OE-23, OE-29 and OE-31. Transgenic Arabidopsis lines; B. Quantitative real-time PCR analysis of CiCHS expression in CiCHS transgenic linesFig.2 Identification and expression analysis of CiCHS in transgenic Arabidopsis

图3 转基因株系AtCHS表达水平检测Fig.3 Expression analysis of AtCHS in transgenic Arabidopsis

2.4 HPLC法检测转基因拟南芥柚皮苷含量

按照1.2.4样品的前处理要求制备样品溶液，按1.2.5的色谱条件对转基因拟南芥的柚皮苷含量进行测定，标样及样品的色谱结果见图5。

由标样和样品的色谱图可以看出，在此色谱条件下分离的柚皮苷峰形尖锐，无拖尾。按此条件绘制的标准曲线为：y=1.475 5×10-5，(R2=0.999 2)，表明在柚皮苷浓度为0～200 μg/mL的范围内该标准曲线线性良好。利用峰面积法计算不同株系拟南芥柚皮苷的含量，结果见表1。由计算结果可知，转基因拟南芥各株系柚皮苷含量均高于野生型，说明CiCHS基因异源表达后增加了拟南芥中柚皮苷的含量。

A. 芦丁标准曲线；B. 拟南芥各株系总黄酮含量；**表示差异极显著(P<0.01)，下同图4 野生型和转CiCHS基因拟南芥总黄酮含量比较A. The standard curve of rutin; B. The content of total flavonoids in different Arabidopsis lines; ** indicates significant difference among samples at 0.01 level, the same as belowFig.4 The content of total flavonoids in different Arabidopsis lines

A. 柚皮苷标准品色谱图；B. 拟南芥各株系色谱图：WT. 黑色线；OE-14. 粉色线；OE-15. 蓝色线；OE-20. 红色线图5 拟南芥各株系柚皮苷色谱结果A. Standard sample; B. The naringin chromatogram map of different Arabidopsis lines: WT. Black line; OE-14. Pink line; OE-15. Blue line; OE-20. Red lineFig.5 The naringin chromatogram result of different Arabidopsis lines

2.5 紫外照射处理对转基因拟南芥MDA含量的影响

前人研究显示紫外等非生物胁迫处理会增加植物中黄酮类等次生代谢产物的积累，从而降低由非生物胁迫引起的植物损伤。本研究对未经紫外照射处理和经紫外照射处理的样品进行MDA含量检测，结果如图6所示，未经紫外照射的野生型和转基因拟南芥中MDA含量差异极明显，经紫外照射处理后野生型和转基因拟南芥中MDA含量均增加，但转基因株系的含量均低于野生型，并且转基因株系与野生型的差异极显著。说明过表达CiCHS减少了正常生长过程中和紫外胁迫处理后拟南芥体内MDA的生成量，从而降低其膜脂过氧化程度，保护植物免受伤害。

表1 转基因和野生型拟南芥柚皮苷含量

图6 紫外处理下拟南芥野生型和转基因株系MDA含量变化Fig.6 The content of MDA in different Arabidopsis lines

2.6 DPPH法检测转基因拟南芥体外抗氧化活性

根据1.2.7的步骤绘制DPPH标准曲线(图7，A)。由标准曲线可知，吸光值y和DPPH浓度x的关系为：y=7.908 3x+0.000 2，(R2=0.999 9)，表明在DPPH浓度为0～0.10 mmol/L的范围内该标准曲线线性良好。按此方法进行转基因拟南芥DPPH自由基的清除率实验，利用测得的吸光值，根据前述方程计算DPPH自由基的清除率，结果见图7，B。3个转基因株系DPPH自由基清除能力明显高于野生型。说明CiCHS基因异源表达后显著增加了拟南芥清除DPPH自由基的能力，且清除能力与基因表达水平呈现剂量关系。

2.7 CiCHS基因部分恢复拟南芥突变体tt4的表型

拟南芥tt4突变体由于AtCHS的缺失而导致种皮无色[23]。本研究将CiCHS基因转入tt4突变体，收取转基因植物T3代种子与tt4和WT进行对比(图8)，发现互补后转基因植物的种皮呈现浅棕色，部分恢复了tt4缺失的表型，说明CiCHS基因在拟南芥中可以参与黄酮代谢，进行花青素类物质的合成，从而赋予拟南芥种皮颜色。

图8 CiCHS基因互补tt4突变体的表型Fig.8 Complementary results of tt4 mutant

A.DPPH标准曲线；B. 不同株系DPPH自由基清除率图7 野生型和转基因拟南芥DPPH自由基的清除率A. The standard curve of DPPH; B. The scavenging rate of DPPH radical of different Arabidopsis linesFig.7 The scavenging rate of DPPH radical of different Arabidopsis lines

3 讨 论

查尔酮合成酶作为植物类黄酮代谢途径的第一个关键酶基因，对植物黄酮类化合物的生成量起决定作用。黄酮类化合物是广泛存在于高等植物中的次生代谢产物，与植物的多种代谢活动密切相关。植物黄酮类花色素的形成受黄酮代谢途径的控制，决定植物花色和种皮色泽。植物体内黄酮类物质含量增加可使植物耐受UV损伤能力、抗病能力等显著提高[9]。

由于基因的共抑制效应，异源CHS基因转化植物时可能引起内源CHS基因表达量降低或不表达，外源CHS基因表达量也会受影响。如Van等的研究结果显示，将DFR和CHS基因转入矮牵牛(Petuniahybrida)后，大多数转基因植株的花色不会发生明显变化，部分转基因植株的色素积累量还会降低，检测发现转基因植物中DFR和CHS基因的表达量明显降低[24]。之后，陆续有人报道了不同植物中转CHS基因引起的共抑制效应。本研究检测了转基因拟南芥中AtCHS基因的表达量，发现过表达株系中AtCHS基因的表达量大概为野生型的十分之一，说明在拟南芥中过表达CiCHS抑制了内源AtCHS基因的表达。但由于CiCHS基因的大量表达，检测结果发现3个过表达株系的总黄酮含量均显著高于野生型，其柚皮苷含量较野生型也有所增加。

研究表明，CHS可以受不同的胁迫处理诱导，如紫外处理、损伤、微生物侵染等，从而导致黄酮类物质含量的增加，使其抗氧化能力提高[9]。Kim等[25]报道紫外光刺激了大豆中黄酮醇的积累，与黄酮醇合酶的诱导表达有关。Jaakola等[26]报道了光照刺激可以促进CHS等黄酮生物合成途径上的关键酶基因，同时也诱导花青素、黄酮醇等化合物含量的提高。丙二醛是植物细胞膜受氧化损伤后的重要产物，通过检测丙二醛的含量可以判断细胞膜的受损程度[27]。本研究发现，3个过表达株系的丙二醛含量在紫外处理前后均低于野生型，说明CiCHS基因异源表达后，使拟南芥的丙二醛生成量减少，膜脂过氧化程度降低。黄酮类化合物具有多酚结构，因此具有很强的清除自由基和抑制由自由基引起的氧化损伤能力。植物清除自由基能力的提高，有利于增加其对自然界的胁迫抗性，如降低因紫外辐射对植物造成的伤害等[28]。本研究发现3个过表达株系清除DPPH自由基的能力均显著高于野生型。

目前，已经在拟南芥中鉴定出22个透明种皮基因(transparent testa, tt)位点，若这些基因不表达，其种皮中类黄酮色素的合成与积累将受阻，种子显示为胚的颜色，呈现典型的黄籽性状。拟南芥CHS基因突变被鉴定为导致透明种皮的tt4位点。原花青素作为拟南芥种皮色素的主要物质在种皮色泽形成中起关键作用，抑制种皮中CHS基因的表达就阻碍了种皮色素的合成途径，使拟南芥的种皮无色，表现为黄籽性状[23]。Sun等[29]在研究中用小苍兰(Freesiahybrida)的FhCHS1互补了拟南芥的tt4突变体，基本补回了种皮的颜色。本研究将CiCHS基因转入拟南芥tt4突变体，观察转基因植物T3代的种皮颜色，发现其种皮呈现浅棕色，说明CiCHS在突变体中可以表达，并有相应的原花青素类物质生成。但互补株系种皮颜色较野生型的棕色明显不同，可能CiCHS只是部分补充了AtCHS的功能，或者生成了其他种类的黄酮类物质而导致原花青素生成量降低，还有待进一步研究证实。

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