甜荞柠檬酸转运蛋白基因FeFRD3的克隆及表达分析

李洪有，钟长春，蔡 芳，霍冬敖，张晓娜，陈庆富*

(1 贵州师范大学 荞麦产业技术研究中心， 贵阳 550001；2 四川农业大学 农学院， 成都 611130)

铁是植物正常生长和发育所必需的微量元素之一，其作为众多金属酶的氧化还原辅因子参与了植物呼吸作用、光合作用、花青素和叶绿素合成等多个重要的生理代谢过程[1-2]。铁缺乏将会影响植物体内激素和叶绿素的合成，造成植株矮化和叶片黄化，严重时将会导致作物大量减产、品质变劣[3-5]。同样，铁元素也是人体必需的营养元素，人体缺铁将会导致缺铁性贫血。据世界卫生组织估计，全球大约有25%的人患有缺铁性贫血。缺铁性贫血将会对人体健康造成严重影响，据统计仅在2010年因缺铁性贫血早死和失能的人就达46 000人之多[6]。虽然已有的方法，如通过增加饮食的多样性和口服含铁制剂对贫血有着较好的预防和治疗作用，但这些方法需要投入较高的成本，不是经济可取的。植物是人类主要的食物来源之一，通过基因操作策略开发富铁作物品种也许是解决这一问题行之有效的方法。但通过基因操作策略不管是开发富铁还是耐铁缺乏作物品种，其前提都需要很好地理解植物铁吸收、转运和分配的分子机制。

通常，植物通过铁转运蛋白将土壤中的二价铁离子转运进根中，随后根中的铁离子以铁-柠檬酸复合体形式由地下部位转运到地上部位，最后分配到各个需要的组织和器官中[3, 7]。在这三个过程中，柠檬酸介导的铁离子由根向地上部位的转运是最为重要的，因为它直接决定了分配到地上部位各组织和器官中的铁含量。植物中第一个被克隆到的参与植物铁由根向地上部位转运的基因是拟南芥AtFRD3[8]。AtFRD3编码蛋白属于MATE(multidrug and toxin efflux)转运蛋白家族成员，利用非洲爪蟾卵母细胞实验证明AtFRD3是一个柠檬酸转运蛋白[9]。AtFRD3突变将会导致突变植物根维管束积累大量的铁，同时减少地上部分铁含量，造成植株叶片黄化，通过嫁接实验和不同生态型拟南芥群体QTL分析进一步证明AtFRD3的功能是将柠檬酸转运到根木质部与铁离子螯合进而促进铁由根向地上部分长距离转运[9-12]。在水稻中，Yokosho等[13]克隆了AtFRD3的同源基因OsFRDL1，该基因主要在根中柱鞘细胞中表达，其突变会造成突变植株叶片黄化，韧皮部汁液柠檬酸含量和地上部分铁含量下降，根部铁含量增加，表明水稻OsFRDL1基因与拟南芥AtFRD3基因具有相同的功能，同时也表明FRD3基因参与铁由根部向地上部位转运的功能在单子叶植物和双子叶植物中是高度保守的。除模式植物拟南芥和水稻外，大豆中也克隆到了FRD3基因的同源基因GmFRD3a和GmFRD3b，但尚缺乏对二者的功能研究[14]。

甜荞作为一种粮药兼用作物，含有丰富的铁元素，其铁含量大约是水稻和小麦的2～3倍[15]。 因此，甜荞不仅是缺铁性病人的理想食物之一，而且还是利用生物强化策略培育富铁作物品种的理想材料。目前，有关荞麦铁吸收和转运的基因的克隆未见报道，其铁吸收和转运的分子机制尚不清楚。本研究利用同源克隆策略结合RT-PCR技术，从甜荞‘赤甜1号’中分离到FeFRD3基因，对该基因序列进行了生物信息学分析，利用qRT-PCR对甜荞不同器官和缺铁、铁过量处理不同时间下根中FeFRD3的表达量进行定量分析，以期为今后深入研究其生理功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试材料为甜荞‘赤甜1号’，由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心保存；大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α由本实验室保存；pMD19-T载体购自大连宝生物公司。

1.2 方 法

1.2.1植物材料处理挑选饱满的甜荞‘赤甜1号’种子，分别用75%乙醇和0.4% NaClO消毒2 min和15 min，用无菌水将种子冲洗干净，再将种子浸泡在无菌水中暗培养12 h，随后将种子播种于盛有营养土(草炭∶蛭石=3∶1)的营养钵中，置于人工气候室培养。待幼苗长至三叶时，取幼苗的根、茎和叶样，并将剩余的长势一致的幼苗转移至全营养液(100 μmol/L EDTA-Fe)中水培5 d，随后将幼苗分为两组，一组在缺铁营养液(1 μmol/L EDTA-Fe)中培养，另一组在高铁营养液(250 μmol/L EDTA-Fe)培养，分别在0、12、24、48、96和144 h取根样。所有样品取样后立即冻于液氮中，并在-80 ℃保存待用。

1.2.2RNA提取及cDNA利用RNA simple Total RNA Kit(天根，北京)试剂盒提取各样本的总RNA，具体操作参照说明书进行；用1.2%的琼脂糖检测RNA的质量和完整性；用NanoDrop2000检测总RNA的纯度和浓度。利用PrimeScript II1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大连)合成第一链cDNA，具体操作参照说明书进行。

1.2.3引物设计与合成根据从甜荞基因组数据库BGBD(Buckwheat Gennome Database, http://buckwheat. kazusa.or.jp/)[16]比对搜索到的推测的FRD3同源基因序列(Fes_sc0002908.1. g000006.aua.1)，利用BioXM 2.6和DNAMAN软件设计基因正向引物KF(5′-ATGGATGGTGGAGGTCAGTT-3′)和反向引物KR(5′-GC GTTAATCGTTAAATCTTAGAA-3′)，扩增甜荞FRD3基因的完整开放阅读框(ORF)；设计表达分析正向引物QF(5′-CTTCGCTTCTTGCTGATGGT-3′)和反向引物QR(5′-CCAAGTCCAACAAGTAGAGC-3′)；根据FeCACS基因序列[17]设计内参基因引物CACSF(5′-AAGACAGTCAGTTTCGTGCCACCTGA-3′)和CACSR(5′-TCCATGCGTGTTCTACCCAACTCCTT-3′)。所有引物均由上海生工生物技术公司合成。

1.2.4目的基因的克隆以反转录合成的根第一链cDNA为模板，PCR扩增目的基因。50 μL PCR反应扩增体系为：5 μL 10×Buffer for KOD-Plus，5 μL dNTPs(2 mmol/L)，2 μL MgSO4(25 mmol/L)，1.5 μL KF(10 μmol/L)，1.5 μL KR(10 μmol/L)，1.5 μL cDNA，1 μL KOD酶，32.5 μL ddH2O。PCR反应程序：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，58 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸1 min 40 s，35个循环；68 ℃ 延伸10 min，12 ℃保存。

PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用DNA回收纯化试剂盒(天根，北京)回收目的片段。目的片段加碱基A反应后与pMD19-T载体16 ℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化子进菌液PCR检测后，送5个阳性克隆到上海生工生物技术公司测序。

1.2.5目的基因生物信息学分析利用NCBI中Blast程序进行序列同源比对；通过BioXM 2.6软件分析ORF，计算编码蛋白的分子量和等电点；利用TMHMM 2.0在线数据库分析蛋白的潜在跨膜区[17]；利用WoLF PSORT(http://wolfpsort.org)在线数据库进行亚细胞定位预测[18]；利用DNAMAN软件进行蛋白序列多序列比对分析；利用ClustalX 1.83 和MEGA 6.0 软件采用NJ(neighbor-joining)法构建系统进化树，重复计算值设1 000次[19]。

1.2.6目的基因的表达分析以根、茎、叶、种子、缺铁和高铁处理不同时间下的根cDNA为模板，以甜荞FeCACS基因作为内参基因，利用基因特异引物QF和QR检测目的基因在不同组织中以及缺铁和高铁处理不同时间下根中的表达情况，每个样品重复3次。PCR反应体系为：5 μL SYRB Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus，2X，TaKaRa，大连)，0.4 μL QF(10 μmol/L)，0.4 μL QR(10 μmol/L)，1 μL cDNA，3.2 μL ddH2O。PCR反应程序：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃ 变性5 s，62 ℃ 退火30 s，39个循环，读取荧光值；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，读取荧光值，计算溶解曲线。利用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达情况。

2 结果与分析

2.1 FeFRD3基因克隆及序列分析

以甜荞幼苗根cDNA为模板，利用基因特异引物KF和KR扩增出一条预期大小约1 500 bp条带(图1)，测序结果显示该片段大小为1 557 bp。利用BioXM 2.6软件分析发现该序列含有一个1 554 bp ORF，编码517个氨基酸，编码蛋白分子量为55.83 kD，等电点为8.48(图2)。利用DNAMAN软件将该cDNA序列及其编码蛋白序列同甜荞基因组数据库中查询到的FRD3同源基因的cDNA序列和蛋白序列比对发现，二者的cDNA序列高度相同，只存在3个多态性核苷酸，同样二者蛋白序列也高度相同，只存在1个氨基酸酸多态性(图2)。因此将其命名为FeFRD3，GenBank注册号为MG462907。

M. DL2000； 1. PCR扩增片段图1 甜荞FeFRD3基因的PCR扩增M. DL2000; 1 represents the amplification fragment of PCRFig.1 PCR amplification of FeFRD3 in Fagopyrum esculentum

2.2 FeFRD3蛋白序列分析

利用NCBI在线数据库对FeFRD3蛋白序列进行Blast比对分析，结果表明，FeFRD3蛋白属于MATE家族蛋白。采用DNAMAN软件对甜荞FeFRD3、拟南芥AtFRD3、大豆GmFRD3a、GmFRD3b和水稻OsFRDL1蛋白序列进行多序列比对分析，结果表明，FeFRD3与其余4个蛋白序列间具有较高的相似性，相似性分别为61%、57%、58%和63%(图3)。用TMHMM 2.0在线数据库对FeFRD3蛋白跨膜结构进行预测，结果发现其存在8个明显的跨膜结构区，8个跨膜区分别位于203～225、246～265、285～307、346～368、383～405、425～447、452～474和481～503氨基酸处(图2)。利用WoLF PSORT在线数据库对FeFRD3进行亚细胞定位预测，结果表明FeFRD3蛋白定位于质膜(主要)和液泡膜上。

2.3 FeFRD3系统进化分析

为进一步探索FeFRD3蛋白与其他物种中已报道的具有柠檬酸转运功能的MATE家族蛋白间的进化关系，选用与铝毒抵抗相关的拟南芥AtMATE、甘蓝BoMATE、玉米ZmMATE1、水稻OsFRDL2和与铁长距离转运相关的拟南芥AtFRD3、大豆GmFRD3a和GmFRD3b、玉米GRMZM2G163154.01和水稻OsFRDL1共9个MATE家族蛋白，利用MEGA 6.0 软件采用NJ法构建了系统进化树。结果如图4所示，10个MATE家族蛋白可以明显分为与铝毒抵抗和铁长距离转运相关两个分支。FeFRD3聚集在具有铁转运功能的MATE蛋白分支中，并与拟南芥的亲缘关系最近，与大豆的亲缘关系次之，与水稻和玉米的亲缘关系最远(图4)。

方框代表单核苷酸或氨基酸多态性；下划线部分为跨膜结构域图2 FeFRD3基因核酸序列及推测的氨基酸序列Frame represents single nucleotide or amino acid polymorphism; underlined represent transmembrane domainFig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of FeFRD3 gene

AtFRD3. 拟南芥; FeFRD3. 甜荞; GmFRD3a、 GmFRD3b. 大豆; OsFRD3. 水稻图3 FeFRD3与其他植物FRD3同源蛋白的多序列比对AtFRD3. Arabidopsis thaliana; FeFRD3. Fagopyrum esculentum; GmFRD3a, GmFRD3b. Glycine max; OsFRD3. Oryza sativaFig.3 Multiple sequence alignment of FeFRD3 protein and FRD3 homologous proteins from other species

AtFRD3、 AtMATE. 拟南芥; BoMATE. 甘蓝; FeFRD3. 甜荞; GmFRD3a、 GmFRD3b. 大豆; OsFRD3、 OsFRDL1. 水稻; ZmMATE、 GRMZM2G163154.01. 玉米图4 FeFRD3蛋白与其他物种MATE家族蛋白的系统进化树AtFRD3, AtMATE. Arabidopsis thaliana; BoMATE. Brassica oleracea; FeFRD3. Fagopyrum esculentum; GmFRD3a, GmFRD3b. Glycine max; OsFRD3, OsFRDL1. Oryza sativa. ZmMATE, GRMZM2G163154.01. Zea maysFig.4 Phylogenic tree of FeFRD3 and other plant MATE family proteins

图5 FeFRD3基因的组织表达Fig.5 Tissue expression profiles of FeFRD3 gene

2.4 FeFRD3基因在不同组织中的表达分析

利用实时荧光定量PCR技术检测FeFRD3基因在不同组织部位中的表达情况，结果如图5所示，FeFRD3基因在根、茎、叶和种子中均有表达，但在不同组织中的表达量不同，其中在根中的表达量最高，大约是叶中的3倍和茎的5倍，在种子中表达量最低，几乎不表达。

2.5 FeFRD3基因对缺铁和高铁胁迫的响应

利用实时荧光定量PCR技术分析FeFRD3基因在根中的表达对缺铁和高铁胁迫的响应，结果如图6所示，缺铁胁迫没有诱导FeFRD3基因在根中的表达；而高铁处理明显诱导了FeFRD3基因在根中的表达，其表达在处理12 h开始受诱导，随后表达量逐渐上升，在96 h表达量达到最大，大约是0 h的3倍，随后表达量开始下降。

-Fe代表缺铁处理；++Fe代表高铁处理图6 FeFRD3基因在缺铁和高铁胁迫下的表达-Fe represent deficiency iron treatment; ++Fe represent high iron treatmentFig.6 Expression levels of FeFRD3 under Fe deficiency and high Fe treatments

3 讨 论

铁元素是植物正常生长和发育必需的营养元素，同时也是人体维持正常生理代谢不可或缺的。植物是人类主要的食物来源之一，其中大部分植物以地上部位作为人类的食源。因此，了解植物尤其是作物中铁由根向地上部位长距离转运的分子机制对利用生物强化策略培育富铁作物品种具有重要指导意义。

本研究从甜荞‘赤甜1号’中克隆了FeFRD3基因。FeFRD3蛋白属于MATE家族。目前，植物MATE家族成员中，具有柠檬酸转运功能的蛋白可以分为参与铝毒抵抗和铁由根向地上部位转运2种。蛋白序列比对分析表明，FeFRD3与拟南芥AtFRD3、大豆GmFRD3a、GmFRD3b和水稻OsFRDL1蛋白序列间有较高的相似性，而与铝毒抵抗相关的拟南AtMATE[22]、甘蓝BoMATE[23]、玉米ZmMATE1[24]和水稻OsFRDL2[25]蛋白序列间的相同性相对较低。系统进化分析表明，FeFRD3与拟南AtFRD3、大豆GmFRD3a、GmFRD3b和水稻OsFRDL1聚为一支，并且与拟南芥AtFRD3亲缘关系最近。这些结果表明，克隆到的FeFRD3基因是FRD3同源基因，其可能具有拟南芥AtFRD3和水稻OsFRDL1基因类似的功能。FeFRD3基因在根、茎和叶中均有表达，在根中表达量最高，这与拟南芥AtFRD3和水稻OsFRDL1基因表达相似[8, 13]，进一步暗示FeFRD3基因可能具有拟南芥AtFRD3和水稻OsFRDL1基因类似的功能。FeFRD3的表达不受缺铁胁迫诱导，这与水稻OsFRDL1的表达相同，但与拟南芥AtFRD3和大豆GmFRD3a、GmFRD3b表达受缺铁胁迫诱导相反，表明在不同物种中，FRD3基因在缺铁胁迫中可能具有不同功能[8, 14]。值得注意的是，虽然FeFRD3基因的表达不受缺铁胁迫诱导，但其表达却明显受高铁胁迫诱导，表明其可能在高铁胁迫下具有将柠檬酸转运进木质部与铁螯合后将根中过多的铁转运到地上部位起着解毒作用。然而，FeFRD3基因是否具有将铁由根向地上部位转运以及参与铁解毒的功能仍需要进一步研究。

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